Differenzierung der embryonalen Stammzellen der Maus in kortikalen Interneuron Vorstufen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.
Abstract
Kortikale GABAergen Interneuronen sind eine heterogene Bevölkerung der Zellen, die kritische Rollen bei der Regelung des Ausgang des exzitatorischen pyramidale Neuronen sowie synchronisieren die Ausgänge der pyramidalen Neuron Ensembles spielen. Defizite im Interneuron Funktion haben in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie verwickelt. Die Ableitung der kortikale Interneurone aus embryonalen Stammzellen nicht nur für das Studium ihrer Entwicklung und Funktion ermöglicht, sondern bietet einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese der kortikalen Interneuron-Erkrankungen. Interneuronen haben auch die bemerkenswerte Fähigkeit, überleben, Migration und Integration in Host kortikalen Schaltung nach Transplantation, so dass sie ideale Kandidaten für den Einsatz in zellbasierten Therapien. Hier präsentieren wir Ihnen eine skalierbare, hocheffiziente, modifizierte Embryoid Körper-Monolayer-Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs). Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6-mit dem Ausdruck nach dem mitotischen Nachkommen isoliert über Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet. Wir bieten auch Methoden bereichern Parvalbumin (PV) oder Somatostatin (SST) Interneuron Untergruppen, die für das Studium Aspekte des Schicksal Bestimmung oder für den Einsatz in therapeutischen Anwendungen möglicherweise hilfreich, die von Interneuron Untergruppe angereicherte profitieren würde Transplantationen.
Introduction
Bei Mäusen und Menschen, rund die Hälfte aller kortikalen hemmenden Interneuronen (CIns) stammen im Rahmen einer vorübergehenden subkortikale Struktur bekannt als mediale ganglionic Eminenz (MGE), wo neuroepithelialer Vorfahren der CIns und anderen neuronalen und Gliazellen Untergruppen Ausdrücken der Transkriptionsfaktor Nkx2.11,2. CIn Untergruppen oder Subtypen sind durch sich überschneidende morphologische, neurochemische, elektrophysiologische und Konnektivität Merkmale3,4definiert. MGE-abgeleitete CIns in gruppiert werden können meist nicht überlappende Untergruppen basierend auf ihren Ausdruck der PV oder SST, der Ausdruck der welche korreliert mit bestimmten elektrophysiologische und Konnektivität Tendenzen5. Dysfunktion von Interneuronen, insbesondere in der PV-Untergruppe hat in mehreren-neuropsychiatrischen Störungen und Krankheiten6,7verwickelt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, mitotischen Vorläuferzellen Stammzellen abgeleitet und wandernden Vorstufen für PV oder SST CIn Schicksal für kortikale Interneuron Biologie zu studieren und für den Einsatz in zellbasierten Therapien angereichert zu produzieren.
Wir haben eine skalierbare und hocheffiziente Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen von mESCs entwickelt. Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Zeile8, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6 exprimierenden Post-mitotischen Nachkommen über FACS isoliert und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet werden können. Durch die Manipulation einer Anzahl der Signalwege, Dauer der Kultur und Modus der Neurogenese, erhalten wir Millionen von Eindringmittel beschrifteten Interneuron Vorstufen für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen geeignet.
Obwohl einige andere Methoden gibt es zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs9,10,11,12,13,14, unsere Methode, die stützt sich auf die Wnt Antagonist XAV-939 ist besonders effizient zu generieren Foxg1/Nkx2.1 Co Teleenzephalischer Vorfahren zum Ausdruck zu bringen. Stark erhöht die Fähigkeit, für Interneuron Stammväter oder Post-mitotischen Lhx6 exprimierenden Nachkommen über unser dual Reporter-System wählen die Fähigkeit, verschiedene Vorfahren und deren Nachkommen zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während diese Methode ist sehr effektiv bei der Musterung J1 abgeleitet mESCs (SCRC-1010), erlebten wir Variablen Erfolg mit anderen mESC Linien und klonale Isolate. Zum Beispiel, Foxg1::venus mESCs (EB3 abgeleitet; Danjo Et al. 13) reagieren schlecht auf dieses Protokoll und Foxg1 Induktion durch DD12 ist in der Regel in der Größenordnung von 1 %-2 %. Aus Gründen, die wir nicht vollständig verstehen, produziert ein weiteres Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter Klon (genannt JQ59)…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, Qing Xu für die Entwicklung der Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual Reporter mESC Linie und Jennifer Tyson, Asif Maroof, sowie Tim Petros für ihre frühen Arbeiten zu helfen, dieses Protokoll zu entwickeln. Wir danken auch den CHOP Flow Cytometry Kern für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 MH066912 (SA) und F30 MH105045-02 (DT) unterstützt.
Materials
| Bottle-top vacuum filter system | Corning | CLS430769 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37 |
| N2 supplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | Do not filter with base media — add after filtration |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39 |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11 |
| L-glutamine (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11 |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11 |
| Tissue culture treated dish (10cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Non-adherent sterile petri dish (10cm) | VWR | 25384-342 | |
| Leukemia inhibitory factor (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| 0.1% Gelatin Solution | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P6282 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11 |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| rhFGF-2 | R&D Systems | 233-FB | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| rhIGF-2 | R&D Systems | 291-G1 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Tocris | 1254 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| Smoothened agonist (SAG) | Millipore | 566660-1MG | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R&D Systems | 464-SH-025 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated | EMD Millipore | 539624 | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
Referências
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