Cortical न्यूरॉन पुरोगामी में माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं का भेदभाव
Summary
यह प्रोटोकॉल एक संशोधित embryoid बॉडी-टू-monolayer पद्धति का उपयोग करके माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से cortical न्यूरॉन progenitors और पोस्ट-mitotic न्यूरॉन पुरोगामी पैदा करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है. इन progenitors/पुरोगामी में इस्तेमाल किया जा सकता है या फ्लोरोसेंट हल और भाग्य दृढ़ संकल्प, या चिकित्सीय अनुप्रयोगों में इस्तेमाल के लिए नवजात neocortex में प्रत्यारोपित ।
Abstract
GABAergic cortical न्यूरॉन्स कोशिकाओं की एक विषम आबादी है कि उत्तेजक पिरामिड न्यूरॉन्स के उत्पादन को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और साथ ही पिरामिड न्यूरॉन पहनावे के outputs तुल्यकालन. घाटा ंयूरॉन समारोह में एक प्रकार का पागलपन, आत्मकेंद्रित, और मिर्गी सहित neuropsychiatric विकारों की एक किस्म में फंसाया गया है । भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से cortical न्यूरॉन्स के व्युत्पत्ति न केवल उनके विकास और समारोह के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, लेकिन आणविक cortical के रोगजनन अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है विकारों से संबंधित. न्यूरॉन्स भी जीवित रहने के लिए उल्लेखनीय क्षमता है, प्रवास, और मेजबान cortical सर्किट के बाद प्रत्यारोपण में एकीकृत, उन्हें सेल आधारित चिकित्सा में उपयोग के लिए आदर्श उम्मीदवार बना. यहाँ, हम एक स्केलेबल, अत्यधिक कुशल, संशोधित embryoid शरीर के लिए monolayer विधि के व्युत्पत्ति के लिए प्रस्तुत nkx 2.1-एक्सप्रेस न्यूरॉन progenitors और उनकी संतान से माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs). एक nkx 2.1 का उपयोग:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरी रिपोर्टर mESC लाइन, nkx 2.1 progenitors या उनके Lhx6-व्यक्त पोस्ट-mitotic संतान प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के माध्यम से अलग किया जा सकता है और बाद में बहाव अनुप्रयोगों की एक संख्या में इस्तेमाल किया । हम भी parvalbumin (पीवी) या सोमेटोस्टेटिन (एसएसटी) के लिए समृद्ध करने के लिए विधियाँ प्रदान करते हैं, जो भाग्य निर्धारण के पहलुओं का अध्ययन करने के लिए या चिकित्सीय अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए सहायक हो सकता है कि न्यूरॉन उपसमूह से लाभ होगा-समृद्ध प्रत्यारोपण ।
Introduction
दोनों चूहों और मनुष्यों में, सभी cortical निरोधात्मक न्यूरॉन्स (CIns) का लगभग आधा औसत दर्जे का ganglionic उभार (MGE) के रूप में जाना एक क्षणिक subcortical संरचना के भीतर उत्पन्न, जहां neuroepithelial के progenitors CIns और अन्य न्यूरॉन और glial उपसमूह प्रतिलेखन कारक nkx 2.11,2व्यक्त । CIn उपसमूह या उपप्रकारों को प्रतिच्छेदन रूपात्मक, neurochemical, electrophysiological और कनेक्टिविटी विशेषताओं3,4द्वारा परिभाषित किया गया है । MGE-व्युत्पन्न CIns या तो PV या एसएसटी की उनकी अभिव्यक्ति के आधार पर ज्यादातर गैर अतिव्यापी उपसमूह में समूहीकृत किया जा सकता है, जो की अभिव्यक्ति विशेष electrophysiological और कनेक्टिविटी प्रवृत्तियों के साथ संबंधित है5. न्यूरॉन्स की शिथिलता, विशेष रूप से PV उपसमूह में उन, कई neuropsychiatric विकारों और रोगों में फंसाया गया है6,7. इस विधि का समग्र लक्ष्य स्टेम सेल-व्युत्पन्न mitotic progenitors और प्रवासी पुरोगामी cortical न्यूरॉन बायोलॉजी के अध्ययन के लिए और सेल-आधारित उपचारों में उपयोग के लिए या तो पीवी या एसएसटी सीन भाग्य के लिए समृद्ध उत्पादन करने के लिए है ।
हम nkx के व्युत्पत्ति के लिए एक स्केलेबल, अत्यधिक कुशल विधि विकसित की है 2.1-व्यक्त progenitors और mESCs से उनकी संतान । एक nkx 2.1 का उपयोग:: mCherry: Lhx6:: GFP दोहरी रिपोर्टर mESC लाइन8, nkx 2.1 progenitors या उनके Lhx6-व्यक्त पोस्ट-mitotic संतान FACS के माध्यम से अलग किया जा सकता है और बाद में बहाव अनुप्रयोगों के एक नंबर में इस्तेमाल किया । संकेत मार्ग, संस्कृति की अवधि, और neurogenesis के मोड की एक संख्या में हेरफेर करके, हम फ्लोरोसेंट के बहाव अनुप्रयोगों के एक मेजबान के लिए उपयुक्त न्यूरॉन्स लेबल के लाखों प्राप्त कर सकते हैं.
हालांकि कई अंय तरीकों mESCs9,10,11,12,13,14, हमारी विधि है, जो Wnt पर निर्भर करता है से MGE-तरह progenitors पैदा करने के लिए मौजूद विरोधी XAV-९३९, Foxg1/nkx 2.1 सह-व्यक्त telencephalic progenitors पैदा करने में विशेष रूप से कुशल है । इसके अतिरिक्त, हमारे दोहरे रिपोर्टर प्रणाली के माध्यम से न्यूरॉन progenitors या उनके पद-mitotic Lhx6-व्यक्त संतान के लिए चयन करने की क्षमता, बहुत अलग progenitors और उनकी संतति उत्पन्न करने की क्षमता को बढ़ाता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
हालांकि इस विधि J1-व्युत्पंन mESCs (SCRC-१०१०) पैटर्न में अत्यधिक प्रभावी है, हम अंय mESC लाइनों और क्लोनी अलग के साथ चर सफलता का अनुभव है । मसलन, Foxg1:: शुक्र mESCs (EB3-व्युत्पन्न; Danjo एट अल. 13) इस प्रोटोकॉल और DD12 द्व…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम nkx 2.1:: mCherry: Lhx6: GFP दोहरी रिपोर्टर mESC रेखा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जेनिफर टायसन, आसिफ मारूफ, और टिम पेट्रो के लिए इस प्रोटोकॉल विकसित करने में मदद करने पर उनके जल्दी काम के विकास के लिए किंग Xu के आभारी हैं । हम भी तकनीकी सहायता के लिए जल्द प्रवाह cytometry कोर का शुक्र है । यह कार्य एक NIH R01 MH066912 (SA) और F30 MH105045-02 (DT) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Bottle-top vacuum filter system | Corning | CLS430769 | |
| Test Tube with Cell Strainer Snap Cap | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37 |
| N2 supplement-B | Stemcell Technologies | 7156 | Do not filter with base media — add after filtration |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39 |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11 |
| L-glutamine (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-Mercaptoethanol | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11 |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11 |
| Tissue culture treated dish (10cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Non-adherent sterile petri dish (10cm) | VWR | 25384-342 | |
| Leukemia inhibitory factor (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| 0.1% Gelatin Solution | ATCC | ATCC PCS-999-027 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P6282 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11 |
| RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| rhFGF-2 | R&D Systems | 233-FB | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| rhIGF-2 | R&D Systems | 291-G1 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| ROCK inhibitor (Y-27632) | Tocris | 1254 | Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots |
| Smoothened agonist (SAG) | Millipore | 566660-1MG | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R&D Systems | 464-SH-025 | Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots |
| PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated | EMD Millipore | 539624 | Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots |
Referências
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