JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Neurociência

Differensiering av mus embryonale stamceller i kortikale Interneuron forløpere

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å generere kortikale interneuron progenitors og post mitotisk interneuron forløpere fra mus embryonale stamceller med en modifisert embryoid kroppen-å-monolayer-metode. Disse progenitors/forløpere kan være brukt i vitro fluorescently sortert og transplantert inn i neonatale neocortex for å studere skjebne bestemmelse eller brukes i terapeutiske programmer.

Abstract

GABAergic kortikale interneurons er en heterogen befolkning som spiller viktige roller i regulerer produksjonen av eksitatoriske pyramidale nevroner, samt synkronisere resultatene av pyramideformet Nevron ensembler. Underskudd i interneuron funksjon har vært innblandet i en rekke nevropsykiatriske lidelser, inkludert schizofreni, autisme og epilepsi. Avledning av kortikale interneurons fra embryonale stamceller ikke bare tillater for studier av deres utvikling og funksjon, men gir innsikt i molekylær mekanismene bak patogenesen av kortikale interneuron-relaterte lidelser. Interneurons har også bemerkelsesverdig evne til å overleve, overføre og integrere vert kortikale krets etter transplantasjon, gjør dem velegnet for bruk i cellen-basert behandling. Her presenterer vi en skalerbar, svært effektiv, endret embryoid kroppen-å-monolayer metode for avledning av Nkx2.1-uttrykke interneuron progenitors og deres avkom fra mus embryonale stamceller (mESCs). Bruker en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbel reporter mESC linje, Nkx2.1 progenitors eller deres Lhx6-uttrykke post mitotisk avkom kan være isolert via fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) og senere brukt i en rekke nedstrøms programmer. Vi tilbyr også metoder for å berike parvalbumin (PV) eller somatostatin (SST) interneuron undergruppene, som kan være nyttig for å studere aspekter av skjebnen bestemmelse eller til bruk i terapeutiske programmer som ville ha nytte interneuron undergruppe-beriket transplantasjoner.

Introduction

Både mus og mennesker, omtrent halvparten av alle kortikale hemmende interneurons (CIns) kommer fra en forbigående subkortikal struktur kalt mediale ganglionic eminense (MGE), hvor de neuroepithelial progenitors av CIns og andre neuronal og glial undergrupper uttrykke transkripsjon faktor Nkx2.11,2. CIn undergrupper eller subtyper defineres av kryssende morfologiske, nevrokjemiske, elektrofysiologiske og tilkobling egenskaper3,4. MGE-avledet CIns kan grupperes i hovedsakelig ikke-overlappende undergrupper basert på deres gjengivelsen av PV eller SST, uttrykk for som korrelerer med bestemte elektrofysiologiske og tilkobling tendenser5. Dysfunksjon av interneurons, særlig de i PV undergruppen, har vært innblandet i flere nevropsykiatriske lidelser og sykdommer6,7. Det overordnede målet med denne metoden er å produsere Stamcelle-avledet mitotisk progenitors og vandrende forløpere beriket for PV eller SST CIn skjebne studere kortikale interneuron biologi og bruk i cellen-basert behandling.

Vi har utviklet en skalerbar og svært effektiv metode for avledning av Nkx2.1-uttrykke interneuron progenitors og deres avkom fra mESCs. Bruker en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbel reporter mESC linje8, Nkx2.1 progenitors eller deres Lhx6-uttrykke post mitotisk avkom kan isolert via FACS og senere brukt i en rekke nedstrøms programmer. Ved å manipulere en rekke signalveier, varighet av kultur og modus for neurogenesis, kan vi få millioner av fluorescently merket interneuron forløpere egnet for en rekke nedstrøms programmer.

Selv om flere andre metoder eksisterer for å generere MGE-lignende progenitors fra mESCs9,10,11,12,13,14, våre metoden, som bruker Wnt antagonist XAV-939, er spesielt effektiv til å generere Foxg1/Nkx2.1 co uttrykke telencephalic progenitors. I tillegg forbedrer muligheten til å velge for interneuron progenitors eller deres post mitotisk Lhx6-uttrykke avkom via to reporter systemet, evnen til å generere forskjellige progenitors og deres avkom.

Protocol

Merk: Dobbelt reporter mESC linjen beskrevet i denne protokollen er tilgjengelig på forespørsel (sande@mail.med.upenn.edu). 1. Media forberedelse Merk: Varm alle medier 37 ° c før bruk i cellekultur. Mus embryonale Fibroblast (MEF) media (for utarbeidelse 500 mL) Legge til 50 mL fosterets bovin serum (FBS) 449 mL av Dulbeccos endret Eagle’s Medium (DMEM), og filtrere gjennom en 500 mL 0.22 µm pore filter enhet. L…

Representative Results

Protokollen beskrevet i denne hvitboken er en modifisert versjon av våre publiserte protokoller15,16,17 og er optimalisert for bruk med vår Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje. Ved å legge den Wnt inhibitor XAV-939 fra DD0-5, kombinert med nytt plating på DD8, oppnå vi robust Nkx2.1 induksjon, der opp 50% av alle DAPI + kjerner i kultur også Nkx2.1 uttrykker (<strong class="x…

Discussion

Denne metoden er svært effektiv på mønstre J1-avledet mESCs (SCRC-1010), har vi opplevd variabel suksess med andre mESC og klonal isolater. For eksempel, Foxg1::venus mESCs (EB3-avledet; Danjo et al. 13) svare dårlig til denne protokollen og Foxg1 induksjon av DD12 er vanligvis på 1-2%. Grunner som vi ikke forstår helt, produserer en annen Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dobbelt reporter klone (kalt JQ59) som ble isolert samtidig som linje beskrevet i denne protokollen (kalt JQ27), mindre…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er takknemlige for Qing Xu for å utvikle Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dobbelt reporter mESC linjen som Jennifer Tyson, Asif Maroof, og Tim Petros for deres tidlig arbeid med å utvikle denne protokollen. Vi takker også CHOP flyt cytometri kjernen for teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 MH066912 (SA) og F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies
check_url/pt/56358?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image