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Neurociência

Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.

Abstract

Gabaérgica interneurônios corticais são uma população heterogênea de células que desempenham um papel crítico em regular a saída de excitatórios neurônios piramidais, bem como sincronizar as saídas dos conjuntos de neurônio piramidal. Déficits na função interneurônio têm sido implicados em uma variedade de distúrbios neuropsiquiátricos, incluindo esquizofrenia, autismo e epilepsia. A derivação de interneurônios corticais de células-tronco embrionárias não só permite o estudo de seu desenvolvimento e função, mas fornece insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese de distúrbios relacionados com interneurônio corticais. Interneurônios também tem a notável capacidade de sobreviver, migrar e integrar acolhimento circuitos corticais pós-transplante, tornando-os candidatos ideais para uso em terapias baseadas em células. Aqui, apresentamos um escalável, altamente eficiente e modificado do embryoid corpo-a-monocamada método para a determinação dos progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Usando uma linha de mESC de repórter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolado através de fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Nós também fornecemos métodos para enriquecer para parvalbumin (PV) ou somatostatina subgrupos de interneurônio (SST), que pode ser útil para estudar os aspectos de determinação de destino ou para uso em aplicações terapêuticas que se beneficiariam de interneurônio subgrupo enriquecido transplantes.

Introduction

Em ambos os ratos e os seres humanos, aproximadamente metade dos interneurônios inibitórios tudo corticais (Cristo) se originam dentro de uma estrutura subcortical transitória, conhecida como a medial Eminência ganglionar (MGE), onde os progenitores neuroepithelial de cinsa e outros neuronal e glial subgrupos expressam o fator de transcrição Nkx2.11,2. Subgrupos de CIn ou subtipos são definidos pela interseção morfológica, neuroquímica, eletrofisiológicos e conectividade características3,4. O MGE-derivado de Cristo pode ser agrupados em subgrupos principalmente não-sobreposição com base em sua expressão de PV ou de SST, a expressão da qual correlaciona-se com particular eletrofisiológicos e conectividade tendências5. Disfunção dos interneurônios, especialmente aqueles no subgrupo PV, tem sido implicada em vários neuropsiquiátricas distúrbios e doenças6,7. O objectivo geral deste método é para produzir células-tronco derivadas de progenitores mitóticas e migratórias precursores enriquecidos para PV ou SST CIn destino para estudar Biologia interneurônio cortical e para uso em terapias baseadas em células.

Nós desenvolvemos um método altamente eficiente, escalável para a derivação de progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de mESCs. Usando uma Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dupla repórter mESC linha8, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolados através de FACS e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Ao manipular um número de vias de sinalização, duração da cultura e modo de neurogênese, podemos obter milhões de precursores interneurônio fluorescente etiquetadas apropriados para uma série de aplicações a jusante.

Apesar de vários outros métodos existem para gerar MGE-como progenitores de mESCs9,10,11,12,13,14, nosso método, que depende o Wnt antagonista Antônio-939, é particularmente eficiente na geração de co expressando progenitores tele-encefálico Foxg1/Nkx2.1. Além disso, a capacidade de selecionar para progenitores interneurônio ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando através do nosso sistema de dupla repórter, aumenta muito a capacidade de gerar distintas progenitores e seus descendentes.

Protocol

Nota: A linha de mESC dupla repórter descrita neste protocolo está disponível mediante solicitação (sande@mail.med.upenn.edu). 1. preparação de mídia Nota: Aquecer todos os meios a 37 ° C antes do uso em cultura de células. Mídia de fibroblasto embrionário mouse (MEF) (para a preparação de 500 mL) Adicione 50 mL soro de bovino fetal (FBS) 449 mL de Dulbecco médio (DMEM modificado águia) e filtrar através de uma …

Representative Results

O protocolo descrito neste documento é uma versão modificada de nossos protocolos publicados15,16,17 e foi otimizado para uso com nossa linha de dual-repórter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Adicionando o inibidor de Wnt Antônio-939 de DD0-5, combinado com o re-chapeamento no DD8, alcançaremos a indução de Nkx2.1 robusta, onde mais de 50% de todos os núcleos DAPI + na cultura são também…

Discussion

Enquanto este método é altamente eficaz na padronização J1-derivado de mESCs (SCRC-1010), nós experimentamos sucesso variável com outras linhas de mESC e isolados clonais. Por exemplo, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivado; Danjo et al 13) responder mal para este protocolo e indução de Foxg1 por DD12 é tipicamente na ordem de 1-2%. Por razões que não entendemos, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP outro repórter dual clone (denominado JQ59) foi isolado simultaneamente como a linha descrita n…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós estamos gratos ao Qing Xu para desenvolver a linha de mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP repórter dual, bem como Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros para seus primeiros trabalhos em ajudar a desenvolver este protocolo. Agradecemos também o núcleo de citometria de fluxo CHOP para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
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Referências

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Citar este artigo
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
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