Este protocolo descreve um método para gerar progenitores interneurônio cortical e pós mitóticas interneurônio precursores de células-tronco embrionárias rato usando um método modificado de corpo-a-monocamada do embryoid. Estes precursores/progenitores pode ser usado em vitro fluorescente classificada e transplantado para o neocórtex neonatal para estudar a determinação do destino ou usado em aplicações terapêuticas.
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Artigo de método
Diferenciação de células estaminais embrionárias de rato em Cortical interneurônio precursores
Neste artigo
Resumo
Resumo
Gabaérgica interneurônios corticais são uma população heterogênea de células que desempenham um papel crítico em regular a saída de excitatórios neurônios piramidais, bem como sincronizar as saídas dos conjuntos de neurônio piramidal. Déficits na função interneurônio têm sido implicados em uma variedade de distúrbios neuropsiquiátricos, incluindo esquizofrenia, autismo e epilepsia. A derivação de interneurônios corticais de células-tronco embrionárias não só permite o estudo de seu desenvolvimento e função, mas fornece insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a patogênese de distúrbios relacionados com interneurônio corticais. Interneurônios também tem a notável capacidade de sobreviver, migrar e integrar acolhimento circuitos corticais pós-transplante, tornando-os candidatos ideais para uso em terapias baseadas em células. Aqui, apresentamos um escalável, altamente eficiente e modificado do embryoid corpo-a-monocamada método para a determinação dos progenitores de interneurônio Nkx2.1-expressando e seus descendentes de células estaminais embrionárias de rato (mESCs). Usando uma linha de mESC de repórter dual Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP, Nkx2.1 progenitores ou seus descendentes pós mitóticas Lhx6-expressando podem ser isolado através de fluorescência-ativado da pilha (FACS) de classificação e posteriormente usado em um número de aplicações a jusante. Nós também fornecemos métodos para enriquecer para parvalbumin (PV) ou somatostatina subgrupos de interneurônio (SST), que pode ser útil para estudar os aspectos de determinação de destino ou para uso em aplicações terapêuticas que se beneficiariam de interneurônio subgrupo enriquecido transplantes.
Introdução
Em ambos os ratos e os seres humanos, aproximadamente metade dos interneurônios inibitórios tudo corticais (Cristo) se originam dentro de uma estrutura subcortical transitória, conhecida como a medial Eminência ganglionar (MGE), onde os progenitores neuroepithelial de cinsa e outros neuronal e glial subgrupos expressam o fator de transcrição Nkx2.11,2. Subgrupos de CIn ou subtipos são definidos pela interseção morfológica, neuroquímica, eletrofisiológicos e conectividade características3,4. O MGE-derivado de Cristo pode ser agrupados em subgrupos princ....
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Protocolo
Nota: A linha de mESC dupla repórter descrita neste protocolo está disponível mediante solicitação (sande@mail.med.upenn.edu).
1. preparação de mídia
Nota: Aquecer todos os meios a 37 ° C antes do uso em cultura de células.
-
Mídia de fibroblasto embrionário mouse (MEF) (para a preparação de 500 mL)
- Adicione 50 mL soro de bovino fetal (FBS) 449 mL de Dulbecco médio (DMEM modificado águia) e filtrar através de uma unidade de filtração 500ml 0.22 µm poro.
- Adicione o agente antimicrobiano de 1 mL (50 mg/mL) após a filtração. Armazenar a mídia em 4 ° C por até 1 mês ou a....
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Resultados
O protocolo descrito neste documento é uma versão modificada de nossos protocolos publicados15,16,17 e foi otimizado para uso com nossa linha de dual-repórter mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Adicionando o inibidor de Wnt Antônio-939 de DD0-5, combinado com o re-chapeamento no DD8, alcançaremos a indução de Nkx2.1 robusta, onde mais de 50% de todos os núcleos DAPI + na cultura são também Nkx2.1 ex.......
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Discussão
Enquanto este método é altamente eficaz na padronização J1-derivado de mESCs (SCRC-1010), nós experimentamos sucesso variável com outras linhas de mESC e isolados clonais. Por exemplo, Foxg1::venus mESCs (EB3-derivado; Danjo et al 13) responder mal para este protocolo e indução de Foxg1 por DD12 é tipicamente na ordem de 1-2%. Por razões que não entendemos, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP outro repórter dual clone (denominado JQ59) foi isolado simultaneamente como a linha descrita neste protoco.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Nós estamos gratos ao Qing Xu para desenvolver a linha de mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP repórter dual, bem como Jennifer Tyson, Asif Maroof e Tim Petros para seus primeiros trabalhos em ajudar a desenvolver este protocolo. Agradecemos também o núcleo de citometria de fluxo CHOP para assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por um NIH R01 MH066912 (SA) e F30 MH105045-02 (DT).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Sistema de filtro a vácuo de topo de garrafa | de ensaio de CLS430769 | Corning | |
| com tampa de pressão de filtro de células | ThermoFisher | Corning 352235 | |
| Fibroblastos embrionários de camundongo (CF-1 MEF IRR 7M) | MTI-Globalstem | GSC-6101G | 1 frasco de 7M MEFs é suficiente para quatro placas TC de 10 cm. Referências: 29,35 |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Primocin | Invivogen | Ant-pm-2 | Também conhecido como agente antimicrobiano. Não filtre com mídia base -- adicione após a filtragem. Referências: 9,11,36,37 |
| N2 suplemento-B | Stemcell Technologies | 7156 | Não filtre com mídia base -- adicione após a filtração |
| Glutamax (100x) | ThermoFisher | 35050061 | Também conhecido como L-alanina-L-glutamina. Referências: 9,11,38,39 |
| KnockOut Reposição de Soro (KSR) | ThermoFisher | 10828028 | Também conhecido como suplemento médio sem soro. Referências: 9,11 |
| L-glutamina (100x) | ThermoFisher | 25030081 | |
| MEM-NEAA (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| 2-mercaptoetanol | ThermoFisher | 21985023 | |
| KnockOut DMEM | ThermoFisher | 10829018 | Também conhecido como DMEM não contendo glutamina. Referências: 9,11 |
| Hyclone FBS | VWR | 82013-578 | Também conhecido como FBS de grau de células estaminais. Referências: 9,11 |
| Placa tratada para cultura de tecidos (10 cm) | BD Falcon | 353003 | |
| Placa de Petri estéril não aderente (10 cm) | VWR | 25384-342 | |
| Fator inibidor da leucemia (mLIF) | Chemicon | ESG1107 | Não congele, armazene a 4'C. Referências: 9,11 |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330032 | |
| Solução de gelatina a 0,1% | ATCC ATCC | PCS-999-027 | |
| Laminina | Sigma | L2020 | |
| Poli-L-lisina | Sigma | P6282 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | ThermoFisher | 25300054 | |
| Accutase | ThermoFisher | A1110501 | Também conhecido como reagente de dissociação celular sem tripsina. Referências: 9,11 |
| RQ1 DNase livre de RNase | Promega | M610A | |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074 | Ressuspender em DMSO e armazenar a -80'C em alíquotas de uso único |
| XAV939 | Stemgent | 04-0046 | Ressuspender em DMSO e armazenar a -80'C em alíquotas de uso único |
| rhFGF-2 | R& D Systems | 233-FB | Ressuspende em PBS com 0,1% BSA e armazena a -80'C em alíquotas de uso |
| único rhIGF-2 | R& D Systems | 291-G1 | Ressuspenda em PBS com 0,1% BSA e armazene a -80'C em alíquotas de uso único |
| Inibidor de ROCK (Y-27632) | Tocris | 1254 | Ressuspenda em DMSO e armazene a -80'C em alíquotas de uso único |
| Agonista suavizado (SAG) | Millipore | 566660-1MG | Ressuspenda em H20 e armazene a -80'C em alíquotas de uso único |
| rm Sonic Hedgehog/SHH | R& D Systems | 464-SH-025 | Ressuspenda em PBS com 0,1% BSA e armazene a -80'C em alíquotas de uso único |
| PKCζ Inibidor de pseudosubstrato, Miristoilado | EMD Millipore | 539624 | ressuspender em H20 e armazenar a -80'C em alíquotas de uso único |
Referências
- Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
- Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696....
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Reimpressões e permissões
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