JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Дифференциация мышиных эмбриональных стволовых клеток в корковых межнейронного прекурсоров

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Этот протокол описывает метод для генерации прародителями корковых межнейронного и пост митотическая межнейронного прекурсоров из мышиных эмбриональных стволовых клеток с помощью модифицированного метода embryoid тело монослоя. Эти предшественники/прекурсоров дневно сортируются и пересадить в неонатальной Неокортекс для изучения определения судьбы может быть использоваться в пробирке или терапевтического применения.

Abstract

ГАМК корковых интернейронов являются гетерогенной популяция клеток, которые играют решающую роль в регулировании вывода возбуждающих нейронов пирамидальный, а также Синхронизация выходов Пирамидальный нейрон ансамблей. Дефицит в межнейронного функции были причастны целый ряд психоневрологических расстройств, шизофрении, аутизм и эпилепсии. Дифференцирование корковых интернейронов из эмбриональных стволовых клеток не только позволяет для изучения их развития и функционирования, но обеспечивает проницательность в молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза корковых расстройств, связанных с межнейронного. Интернейронов также имеют замечательную способность выжить, миграции и интеграции в принимающей корковых схемы после трансплантации, что делает их идеальными кандидатами для использования в терапии на основе ячеек. Здесь мы представляем масштабируемый, высокоэффективных, модифицированных embryoid тело монослоя метод для расчета Nkx2.1 выражая прародителями межнейронного и их потомков из мышиных эмбриональных стволовых клеток (mESCs). С помощью Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP двойной репортер mESC линии, Nkx2.1 прародителями или их Lhx6-выражая пост митотическая потомства можно изолировали через активированный флуоресценции клеток, сортируя (FACS) и впоследствии используется в ряде нисходящие приложения. Мы также предоставляют методы для обогащения Парвальбумин (PV) или соматостатина (SST) межнейронного подгрупп, которые могут быть полезны для изучения аспектов определения судьбы или для использования в терапевтических приложений, которые выиграют от межнейронного подгруппа обогащенный трансплантаций.

Introduction

В обоих мышей и людей, примерно половина всех корковых ингибирующее интернейронов (ЦИН) происходят в рамках переходных подкорковые структуры, известный как медиальный Ганглиозный возвышение (MGE), где нейроэпителиальных прародителями Цин и других нейронов и глиальных подгруппы Экспресс фактор транскрипции Nkx2.11,2. Цин подгрупп или подтипы определяются пересекающихся морфологических, нейрохимических, электрофизиологических и подключения характеристики3,4. Цин МГЕ производные могут быть сгруппированы в основном non перекроя подгруппы на основе их выражения PV или SST, выражение которого коррелирует с частности электрофизиологических и подключения тенденции5. Дисфункция интернейронов, особенно те, в подгруппе PV, был вовлечен в несколько нервно-психических расстройств и заболеваний6,7. Общая цель этого метода-производить стволовых клеток митотическая прародителями и мигрирующих прекурсоров, обогащенные для PV или SST CIn судьбу для изучения биологии корковых межнейронного и для использования в терапии на основе ячеек.

Мы разработали масштабируемый, высокоэффективный метод для расчета Nkx2.1 выражая прародителями межнейронного и их потомства от mESCs. С помощью Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP двойной репортер mESC линии8, Nkx2.1 прародителями или их Lhx6-выражая пост митотическая потомства может быть изолирован через СУИМ и впоследствии используется в ряде нисходящие приложения. Изменяя количество сигнальных путей, продолжительность культуры и режим нейрогенез, мы можем получить миллионы дневно обозначенные межнейронного прекурсоров для множество нисходящие приложения.

Хотя существуют несколько других методов для генерации МГЕ как предшественники из mESCs9,10,11,12,13,14, наш метод, который опирается на Wnt антагонист Демонического-939, особенно эффективен при генерации Foxg1/Nkx2.1 совместно выражая telencephalic прародителями. Кроме того возможность выбора для межнейронного прародителями или их пост митотическая Lhx6-выражая потомства через нашу систему двойного репортер, значительно повышает способность генерировать собственный прародителями и их потомства.

Protocol

Примечание: Линия mESC двойной репортер, указанных в настоящем Протоколе доступен по запросу (sande@mail.med.upenn.edu). 1. средства массовой информации подготовка Примечание: Теплый все средства массовой информации до 37 ° C перед использованием в клеточной культуре. <ol…

Representative Results

Протокол, описанные в настоящем документе представляет собой модифицированную версию нашего опубликованные протоколы по15,16,17 и оптимизирована для использования с нашей линии двойной репортер mESC Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Путем…

Discussion

Хотя этот метод очень эффективен на кучность J1-производные mESCs (ПКРК-1010), мы испытали переменным успехом с другими mESC линий и клоновых изолятов. К примеру, Foxg1::venus mESCs (EB3-производных; Danjo и др. 13) реагируют плохо этот протокол и Foxg1 индукции, DD12 обычно составляет порядка 1-2%. П…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Цин Сюй для разработки Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP двойной репортер mESC линии, а также Дженнифер Тайсон, Асиф Маруф и Тим Петрос для их ранние работы на оказание помощи в разработке этого протокола. Мы также благодарим Чоп потока цитометрии ядро для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана NIH R01 MH066912 (SA) и F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies
check_url/pt/56358?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image