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Neurociência

Diferenciación de células madre embrionarias de ratón en precursores corticales interneurona

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Este protocolo describe un método para generar progenitores interneurona cortical y poste-mitotic interneurona precursores de células madre embrionarias del ratón usando un método modificado de cuerpo para monocapa embryoid. Estos progenitores/precursores puede ser usado en vitro fluorescencia ordenados y trasplantado en neocortex neonatal para el estudio de determinación de destino o utilizado en aplicaciones terapéuticas.

Abstract

Interneuronas corticales de GABAérgico son una población heterogénea de células que desempeñan un papel crítico en la regulación de la salida de neuronas piramidales excitatorias como sincronizar las salidas de conjuntos de neuronas piramidales. Déficits en la función de interneurona se han implicado en una variedad de trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo autismo, la esquizofrenia y la epilepsia. La derivación de interneuronas corticales de las células madre embrionarias no sólo permite el estudio de su desarrollo y función, sino que proporciona una idea de los mecanismos moleculares subyacentes a la patogénesis de trastornos relacionados con la interneurona corticales. Interneuronas también tienen la notable capacidad de sobrevivir, migrar e integrar en host circuitos corticales poste-trasplante, haciéndolos candidatos ideales para su uso en terapias basadas en células. Aquí, presentamos un método de cuerpo para monocapa embryoid escalable, altamente eficiente, modificado para la derivación de expresa Nkx2.1 interneurona progenitores y su progenie de células madre embrionarias de ratón (troncales). Usando una línea de Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP doble reportero mESC, Nkx2.1 progenitores o su progenie poste-mitotic expresando Lhx6 puede ser aislado a través de células activado por fluorescencia (FACS) de clasificación y posteriormente utilizado en un número de aplicaciones posteriores. También ofrecemos métodos para enriquecer parvalbúmina (PV) o somatostatina subgrupos de interneurona (SST), que puede ser útil para estudiar aspectos de la determinación de destino o para su uso en aplicaciones terapéuticas que se beneficiarían de interneurona enriquecido de subgrupo trasplantes.

Introduction

En ratones y seres humanos, aproximadamente la mitad de todo corticales inhibitorios interneurons (CIns) originan dentro de una estructura subcortical transitoria conocida como la eminencia ganglionar medial (MGE), donde los progenitores neuroepiteliales de CIns y neuronal y glial los subgrupos expresan el factor de transcripción Nkx2.11,2. CIn los subgrupos o subtipos son definidos por la intersección electrofisiológicos, neuroquímicos y morfológicas y características de conectividad de3,4. El CIns derivado de MGE se pueden agrupar en subgrupos no superpuestos sobre todo basan en su expresión de PV o SST, la expresión de que se correlaciona con particular electrofisiológicos y conectividad tendencias5. Disfunción de interneuronas, especialmente ésos en el subgrupo de PV, se ha implicado en múltiples neuropsiquiátricos desórdenes y enfermedades6,7. El objetivo general de este método es producir derivados de células mitóticas progenitores y precursores migratorias enriquecidos por PV o SST CIn destino para estudiar biología cortical interneurona y para uso en terapias basadas en células.

Hemos desarrollado un método escalable, altamente eficiente para la derivación de expresa Nkx2.1 interneurona progenitores y su progenie de troncales. Utilizando un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP reportero doble mESC línea8, Nkx2.1 progenitores o su progenie poste-mitotic expresando Lhx6 puede ser aislado por FACS y posteriormente utilizado en un número de aplicaciones posteriores. Mediante la manipulación de un número de vías de señalización, duración de la cultura y modo de la neurogénesis, podemos obtener millones de precursores de interneurona fluorescente etiquetado adecuados para multitud de aplicaciones posteriores.

Aunque existen varios otros métodos para la generación de MGE-como progenitores de troncales9,10,11,12,13,14, nuestro método, que depende de la Wnt antagonista XAV-939, es particularmente eficaz en generar Foxg1/Nkx2.1 Co expresando progenitores telencéfalo. Además, la capacidad para seleccionar progenitores interneurona o su progenie poste-mitotic Lhx6 expresando a través de nuestro sistema dual de reportero, realza grandemente la capacidad de generar distintos progenitores y su progenie.

Protocol

Nota: La línea de mESC reportero dual descrita en el presente Protocolo está disponible a petición (sande@mail.med.upenn.edu). 1. preparación de medios de comunicación Nota: Calentar todos los medios a 37 ° C antes de su uso en cultivo celular. Medios de fibroblastos embrionarios del ratón (MEF) (para la preparación de 500 mL) Añadir el suero bovino fetal (FBS) de 50 mL a mL 449 de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM…

Representative Results

El protocolo descrito en este documento es una versión modificada de nuestros protocolos publicados15,16,17 y ha sido optimizado para su uso con nuestra línea de mESC dual-reportero de Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Mediante la adición de los inhibidores de Wnt XAV-939 de DD0-5, combinado con nuevo chapado en DD8, logramos robusta inducción Nkx2.1, en donde más del 50% de todos los núcleos DAPI…

Discussion

Mientras que este método es altamente efectivo en patrones derivados de J1 troncales (SCRC-1010), hemos experimentado éxito variable con otras líneas de mESC y aislamientos clonales. Por ejemplo, Foxg1::venus troncales (EB3-derivado; Danjo et al. 13) responden mal a este protocolo y Foxg1 inducción por DD12 es típicamente del orden de 1-2%. Por razones que no entendemos, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP otro reportero doble clon (llamado JQ59) fue aislado simultáneamente como la línea des…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a Xu Qing para el desarrollo de la Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP reportero doble mESC línea como Jennifer Tyson, Asif Maroof y Tim Petros por su temprano trabajo en ayudar a desarrollar este protocolo. También agradecemos a la base de citometría de flujo CHOP para asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por un NIH R01 MH066912 (SA) y F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
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Referências

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Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
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