JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Differentiering av mus embryonala stamceller till kortikala Interneuron prekursorer

Published: December 03, 2017
doi:
10.3791/56358
,
1Neuroscience Graduate Group, Perelman School of Medicine,University of Pennsylvania, 2Department of Psychiatry, Children’s Hospital of Philadelphia,University of Pennsylvania School of Medicine

Summary

Det här protokollet beskriver en metod för att generera kortikala interneuron stamfäder och efter mitotiska interneuron prekursorer från mus embryonala stamceller med en modifierad embryoid kropp-till-enskiktslager metod. Dessa stamfäder/prekursorer kan vara används in vitro- fluorescently sorterade och transplanteras i neonatal hjärnbarken för att studera öde bestämning eller används i terapeutiska tillämpningar.

Abstract

GABAergic kortikala interneuroner är en heterogen population av celler som spelar avgörande roller i reglerar produktionen av excitatoriska pyramidal nervceller samt synkronisera utgångarna av pyramidal neuron ensembler. Underskott i interneuron funktion har varit inblandade i en mängd olika neuropsykiatriska störningar, schizofreni, autism och epilepsi. Härledningen av kortikala interneuroner från embryonala stamceller inte bara tillåter för att studera deras utveckling och funktion, men ger en inblick i de molekylära mekanismer bakom patogenesen av kortikala interneuron-relaterade sjukdomar. Interneuroner har också en anmärkningsvärd förmåga att överleva, migrera och integrera i värd kortikala kretsar efter transplantation, vilket gör dem till perfekta kandidater för användning i cellbaserade terapier. Här presenterar vi en skalbar, högeffektiva, modifierad embryoid kropp-till-enskiktslager metod för härledning av Nkx2.1-uttryckande interneuron stamfäder och deras avkomma från mus embryonala stamceller (mESCs). Använda en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linje, kan Nkx2.1 stamfäder eller deras Lhx6-uttryckande efter mitotiska avkommor isoleras via fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) och därefter används i ett antal nedströms tillämpningar. Vi ger också metoder för att berika för parvalbumin (PV) eller somatostatin (SST) interneuron undergrupper, som kan vara till hjälp för att studera aspekter av öde bestämning eller för användning i terapeutiska tillämpningar som skulle dra nytta av interneuron undergruppen-berikad transplantationer.

Introduction

Både möss och människor, ungefär hälften av alla kortikala hämmande interneuroner (CIns) har sitt ursprung inom en övergående subkortikala struktur som kallas den mediala ganglieblockerande eminens (MGE), där neuroepithelial föräldraparets CIns och andra neuronala och gliaceller undergrupper express Transkriptionfaktorn Nkx2.11,2. CIn undergrupper eller subtyper definieras av korsande morfologiska, neurokemiska, elektrofysiologiska och anslutningsmöjligheter egenskaper3,4. Den MGE-derived CIns kan grupperas i mestadels icke-överlappande undergrupper baserat på deras uttryck för antingen PV eller SST, uttrycket av som korrelerar med särskilt elektrofysiologiska och anslutning tendenser5. Dysfunktion i interneuroner, särskilt de i undergruppen som PV har varit inblandad i flera neuropsykiatriska sjukdomar och åkommor6,7. Det övergripande målet med denna metod är att producera stamceller-derived mitotiska stamfäder och flyttande prekursorer berikad för antingen PV eller SST CIn öde för att studera kortikala interneuron biologi och för användning i cellbaserade terapier.

Vi har utvecklat en skalbar, mycket effektiv metod för bestämning av Nkx2.1-uttryckande interneuron stamfäder och deras avkomma från mESCs. Använder en Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC linje8, Nkx2.1 stamfäder eller deras Lhx6-uttryckande efter mitotiska avkomma kan vara isolerade via FACS och därefter används i ett antal nedströms tillämpningar. Genom att manipulera ett antal signalvägar, varaktighet av kultur och mode av neurogenes, kan vi få miljontals fluorescently märkt interneuron prekursorer lämplig för en mängd nedströms applikationer.

Även om det finns flera andra metoder för att generera MGE-liknande stamfäder från mESCs9,10,11,12,13,14, vår metod, som bygger på Wnt antagonist XAV-939, är särskilt effektiv på att skapa Foxg1/Nkx2.1 Co uttrycker telencephalic stamfäder. Dessutom förbättrar möjligheten att välja för interneuron föräldraparets eller deras efter mitotiska Lhx6-uttryckande avkommor via vårt dubbla reporter system, kapacitet att generera tydliga stamfäder och deras avkomma.

Protocol

Obs: Dubbla reporter mESC linjen beskrivs i detta protokoll är tillgängliga på begäran (sande@mail.med.upenn.edu). 1. Media förberedelse Obs: Varma alla medier till 37 ° C före användning i cellkultur. Mus embryonala Fibroblast (MEF) media (för att förbereda 500 mL) Tillsätt 50 mL fetalt bovint serum (FBS) till 449 mL Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM) och filtrera genom en 500 mL 0,22 µm porstorlek filteren…

Representative Results

Protokollet beskrivs i detta dokument är en modifierad version av vår publicerade protokoll15,16,17 och har optimerats för användning med våra Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual-reporter mESC linje. Genom att lägga till den Wnt-hämmaren XAV-939 från DD0-5, kombinerat med nytt plätering på DD8, uppnå vi robust Nkx2.1 induktion, vari uppemot 50% av alla DAPI + kärnor i kultur också Nkx2.1 …

Discussion

Även denna metod är mycket effektiv vid mönstring J1-derived mESCs (SCRC-1010), har vi upplevt varierande framgång med andra mESC linjer och klonal isolat. Exempelvis Foxg1::venus mESCs (EB3-härlett; Danjo o.a. 13) svara dåligt på detta protokoll och Foxg1-induktion av DD12 är vanligtvis storleksordningen 1-2%. Av skäl som vi inte förstår, producerar en annan Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dubbla reporter klon (kallas JQ59) som var isolerad samtidigt som den linje som beskrivs i det…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi är tacksamma mot Qing Xu för att utveckla den Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dubbla reporter mESC linje och Jennifer Tyson, Asif Maroof, samt Tim Petros för deras tidiga arbete med att hjälpa till att utveckla detta protokoll. Vi tackar också CHOP flöde flödescytometri kärnan för tekniskt bistånd. Detta arbete stöds av en NIH R01 MH066912 (SA) och F30 MH105045-02 (DT).

Materials

Bottle-top vacuum filter system Corning CLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap Cap ThermoFisher Corning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M) MTI-Globalstem GSC-6101G 1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBS Atlanta Biologicals S11150H
Primocin Invivogen Ant-pm-2 Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media — add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-B Stemcell Technologies 7156 Do not filter with base media — add after filtration
Glutamax (100x) ThermoFisher 35050061 Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR) ThermoFisher 10828028 Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x) ThermoFisher 25030081
MEM-NEAA (100x) ThermoFisher 11140050
2-Mercaptoethanol ThermoFisher 21985023
KnockOut DMEM ThermoFisher 10829018 Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBS VWR 82013-578 Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm) BD Falcon 353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm) VWR 25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF) Chemicon ESG1107 Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12 ThermoFisher 11330032
0.1% Gelatin Solution ATCC ATCC PCS-999-027
Laminin Sigma L2020
Poly-L-lysine Sigma P6282
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisher 25300054
Accutase ThermoFisher A1110501 Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNase Promega M610A
LDN-193189 Stemgent 04-0074 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939 Stemgent 04-0046 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2 R&D Systems 233-FB Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2 R&D Systems 291-G1 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632) Tocris 1254 Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG) Millipore 566660-1MG Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHH R&D Systems 464-SH-025 Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, Myristoylated EMD Millipore 539624 Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jones, E. G. The origins of cortical interneurons: mouse versus monkey and human. Cereb Cortex. 19, 1953-1956 (2009).
  2. Wonders, C. P., Anderson, S. A. The origin and specification of cortical interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 7 (6), 687-696 (2006).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature reviews. Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature reviews. Neuroscience. 14, 202-216 (2013).
  5. Xu, X., Roby, K. D., Callaway, E. M. Immunochemical characterization of inhibitory mouse cortical neurons: three chemically distinct classes of inhibitory cells. J Comp Neurol. 518, 389-404 (2010).
  6. Inan, M., Petros, T. J., Anderson, S. A. Losing your inhibition: Linking cortical GABAergic interneurons to schizophrenia. Neurobiol Dis. 53, 36-48 (2013).
  7. Benes, F. M., Berretta, S. GABAergic interneurons: implications for understanding schizophrenia and bipolar disorder. Neuropsychopharmacology. 25, 1-27 (2001).
  8. Tyson, J. A., Goldberg, E. M., Maroof, A. M., Petros, T. P., Anderson, S. A. Duration of culture and Sonic Hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  9. Au, E., et al. A modular gain-of-function approach to generate cortical interneuron subtypes from ES cells. Neuron. 80, 1145-1158 (2013).
  10. Petros, T. J., Maurer, C. W., Anderson, S. A. Enhanced derivation of mouse ESC-derived cortical interneurons by expression of Nkx2.1. Stem Cell Res. 11, 647-656 (2013).
  11. Cambray, S., et al. Activin induces cortical interneuron identity and differentiation in embryonic stem cell-derived telencephalic neural precursors. Nat Commun. 3, 841 (2012).
  12. Chen, Y. J., et al. Use of “MGE Enhancers” for Labeling and Selection of Embryonic Stem Cell-Derived Medial Ganglionic Eminence (MGE) Progenitors and Neurons. PloS one. 8, e61956 (2013).
  13. Danjo, T., et al. Subregional specification of embryonic stem cell-derived ventral telencephalic tissues by timed and combinatory treatment with extrinsic signals. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 1919-1933 (2011).
  14. Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  15. Tyson, J. A., et al. Duration of culture and sonic hedgehog signaling differentially specify PV versus SST cortical interneuron fates from embryonic stem cells. Development. 142, 1267-1278 (2015).
  16. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12, 559-572 (2013).
  17. Tischfield, D. J., Kim, J., Anderson, S. A. Atypical PKC and Notch Inhibition Differentially Modulate Cortical Interneuron Subclass Fate from Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 8, 1135-1143 (2017).
  18. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 3078-3089 (2007).
  19. Du, T., Xu, Q., Ocbina, P. J., Anderson, S. A. NKX2.1 specifies cortical interneuron fate by activating Lhx6. Development. 135, 1559-1567 (2008).
  20. Marin, O., Anderson, S. A., Rubenstein, J. L. Origin and molecular specification of striatal interneurons. Journal of Neuroscience. 20, 6063-6076 (2000).
  21. Xu, Q., Wonders, C. P., Anderson, S. A. Sonic hedgehog maintains the identity of cortical interneuron progenitors in the ventral telencephalon. Development. 132, 4987-4998 (2005).
  22. Glickstein, S. B., Alexander, S., Ross, M. E. Differences in cyclin D2 and D1 protein expression distinguish forebrain progenitor subsets. Cereb Cortex. 17, 632-642 (2007).
  23. Petros, T. J., Bultje, R. S., Ross, M. E., Fishell, G., Anderson, S. A. Apical versus Basal Neurogenesis Directs Cortical Interneuron Subclass Fate. Cell Rep. 13, 1090-1095 (2015).
  24. Xu, Q., Tam, M., Anderson, S. A. Fate mapping Nkx2.1-lineage cells in the mouse telencephalon. J Comp Neurol. 506, 16-29 (2008).
  25. Wonders, C. P., et al. A spatial bias for the origins of interneuron subgroups within the medial ganglionic eminence. Dev Biol. 314, 127-136 (2008).
  26. Inan, M., Welagen, J., Anderson, S. A. Spatial and temporal bias in the mitotic origins of somatostatin- and parvalbumin-expressing interneuron subgroups and the chandelier subtype in the medial ganglionic eminence. Cereb Cortex. 22, 820-827 (2012).
  27. Flames, N., et al. Delineation of multiple subpallial progenitor domains by the combinatorial expression of transcriptional codes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 9682-9695 (2007).
  28. Fogarty, M., et al. Spatial genetic patterning of the embryonic neuroepithelium generates GABAergic interneuron diversity in the adult cortex. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 10935-10946 (2007).
  29. Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
  30. Colasante, G., et al. Rapid Conversion of Fibroblasts into Functional Forebrain GABAergic Interneurons by Direct Genetic Reprogramming. Cell Stem Cell. 17, 719-734 (2015).
  31. Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. Origins of cortical interneuron subtypes. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 2612-2622 (2004).
  32. Southwell, D. G., et al. Interneurons from embryonic development to cell-based therapy. Science. 344, 1240622 (2014).
  33. Tyson, J. A., Anderson, S. A. GABAergic interneuron transplants to study development and treat disease. Trends Neurosci. 37, 169-177 (2014).
  34. Donegan, J. J., et al. Stem cell-derived interneuron transplants as a treatment for schizophrenia: preclinical validation in a rodent model. Mol Psychiatry. , (2016).
  35. Deglincerti, A., et al. Self-organization of human embryonic stem cells on micropatterns. Nat Protoc. 11, 2223-2232 (2016).
  36. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  37. Wang, J., et al. Isolation and cultivation of naive-like human pluripotent stem cells based on HERVH expression. Nat Protoc. 11, 327-346 (2016).
  38. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nat Med. 22, 1421-1427 (2016).
  39. Blahos, J., et al. A novel site on the Galpha -protein that recognizes heptahelical receptors. J Biol Chem. 276, 3262-3269 (2001).

Tags

Mouse Embryonic Stem CellsCortical Interneuron ProgenitorsNkx2.1ParvalbuminSomatostatinMEF Feeder CellsTrypsin-EDTAGelatin-coated PlatesKSR-N2 MediaEmbryoid Bodies
check_url/pt/56358?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Tischfield, D. J., Anderson, S. A. Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors. J. Vis. Exp. (130), e56358, doi:10.3791/56358 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image