JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Real-time skælven-induceret konvertering Assay til påvisning af CWD prioner i Fecal materiale

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at beskrive en enkel, hurtig og effektiv prion amplifikationsteknologi, real-time skælven-induceret (RT-QuIC) konverteringsmetode.

Abstract

RT-QuIC teknikken er en følsomme i vitro celle-fri prion forstærkning assay hovedsagelig baseret på de seedede misfoldning og sammenlægning af rekombinant prion protein (PrP) substrat ved hjælp af prioner frø som en skabelon for konverteringen. RT-QuIC er en roman høj overførselshastighed teknik, der er analog til real-time Polymerasekædereaktionen (PCR). Påvisning af amyloid fibril vækst er baseret på farvestoffet Thioflavin T, der fluorescerer ved specifik interaktion med ᵦ-ark rige proteiner. Således kan amyloid dannelse påvises i realtid. Vi forsøgte at udvikle en pålidelig non-invasiv screeningstest for at påvise kroniske wasting disease (CWD) prioner i fecal ekstrakt. Her har vi specielt tilpasset RT-QuIC teknikken for at afsløre PrPSc såning aktivitet i afføring fra CWD inficeret hjortedyr. I første omgang var seeding aktiviteten af fækal ekstrakterne vi forberedt forholdsvis lav i RT-QuIC, muligvis på grund af potentielle assay hæmmere i fecal materiale. For at forbedre seeding aktivitet af afføring ekstrakter og fjerne potentielle assay hæmmere, homogeniseret vi fækal prøverne i en buffer, som indeholder vaske-og rengøringsmidler og proteasehæmmere. Vi har også forelagt prøverne med forskellige metoder at koncentrere PrPSc på grundlag af protein nedbør ved hjælp af natrium phosphorwolfram syre, og centrifugalkraften. Endelig, afføring ekstrakter blev testet af optimeret RT-QuIC som omfattede substrat udskiftning i protokollen at forbedre følsomheden af påvisning. Dermed, vi etableret en protokol for følsomme påvisning af CWD prion såning aktivitet i afføring af prækliniske og kliniske hjortedyr af RT-QuIC, som kan være et praktisk værktøj for non-invasiv CWD diagnose.

Introduction

Prionsygdomme eller transmissible spongiforme encephalopatier (TSE) er neurodegenerative sygdomme herunder Creutzfeldt – Jakob sygdom (CJD) hos mennesker, bovin spongiform encephalopati (BSE) hos kvæg, scrapie hos får og geder og kronisk spilde sygdom (CWD) i hjortedyr 1,2. TSE er kendetegnet ved karakteristiske spongiforme udseende og tab af neuroner i hjernen. Ifølge “protein kun” hypotese, er prioner hovedsageligt komponeret af PrPSc (“Sc” for scrapie) 3, en fejlfoldede isoform af den vært-kodet cellulære prion, PrPC. PrPSc resultater fra omdannelse af PrPC til en kropsbygning, beriget med ᵦ-ark 4,5,6 , som kan fungere som en frø til at binde og konvertere andre PrPC molekyler. De nyligt genererede PrPSc molekyler er indarbejdet i en voksende polymer 7,8 der bryder i mindre oligomerer, hvilket resulterer i højere antal smitsomme kerner. PrPSc er tilbøjelige til akkumulering og er delvist resistente over for proteaser 9,10.

CWD påvirker vilde og opdrættede elg (Cervus canadensis), mule deer (Odocoileus hemionus), hvide – tailed hjorte (WTD; Odocoileus virginianus), moose (Alces alces), og rensdyr (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Det betragtes som den mest smitsomme prioner sygdom med horisontal overførsel begunstiget af cervid interaktioner og miljømæssige persistens af smitteevne 14,15. I modsætning til andre prionsygdomme, hvor PrPSc ophobning og smitteevne er begrænset til hjernen, i CWD findes disse også i perifere væv og legemsvæsker f.eks. spyt, urin og afføring 16,17, 18.

Immunhistokemi betragtes som guldstandarden for CWD diagnose at opdage PrPSc distribution og spongiform læsioner 19,20. ELISA og i mere sjældne tilfælde, vestlige skamplet bruges også til CWD diagnostik. Således er aktuelle prion sygdom diagnose hovedsagelig baseret på påvisning af prioner i post mortem væv. Ante mortem diagnose for CWD er tilgængelig ved at tage mandler eller recto-anal slimhinde-associerede lymfoide væv (RAMALT) biopsier; men denne procedure er invasiv og kræver erobringen af dyrene. Således ville brug af let tilgængelige enheder, såsom urin og afføring, være en praktisk måde for CWD prion påvisning. Men disse ekskrementer fra havnen relativt lave koncentrationer af prioner under detektionsgraensen for nuværende diagnostiske metoder. Er derfor behov for en mere følsom og høj overførselshastighed diagnostisk værktøj. In vitro konvertering systemer, såsom protein misfoldning cykliske forstærkning assay (PMCA) 21, amyloid såning assay, og real-time skælven-induceret konvertering (RT-QuIC) assay 22,23, 24 er meget effektive værktøjer til at udnytte PrPSc selvstændig formeringsmateriale evne til at efterligne i vitro prion konvertering proces og dermed forstærke tilstedeværelsen af små mængder af PrPSc til påviselige mængder 25 ,26. Metoden RT-QuIC imidlertid udnytter det faktum, at konvertering produktet beriget med β-plade sekundærstruktur specifikt kan binde thioflavin T (Th-T). Derfor vokser rekombinant PrP (rPrP) ved seedede konvertering ind i amyloid fibriller, som binder Th-T og dermed kan blive opdaget i realtid ved at måle fluorescens af Th-T udtrykt som relativ fluorescens enheder (RFU) over tid. Når overvåges, kan RFU bruges til at evaluere relative seeding aktiviteter og kvantitative parametre såsom den mellemliggende fase. Den mellemliggende fase repræsenterer klokkeslæt (h) kræves for at nå den tærskel, under hvilken rPrP konvertering på det tidlige stadium af reaktionen er under detektionsgrænsen for Th-T fluorescens. Slutningen af fasen synlige lag samtidig til dannelsen af en tilstrækkelig amyloid kernen (Nukleering/brudforlængelse), opstår, når Th-T fluorescens overstiger tærskelværdien og bliver positiv. Vækst af amyloid fibriller kan påvises i realtid og indledende PrPSc eller seeding aktivitet indeholdt i prøven forstærkes af segmentering, der genererer flere frø. Disse frø fremkalde igen en hurtig eksponentiel fase af amyloid fiber vækst.

Fordi dette assay er købedygtig opdager så lavt som 1 fg PrPSc 24, den højfølsomme kvalificerer denne teknik til at opnå ante mortem eller non-invasiv diagnose ved påvisning af PrPSc i forskellige perifere væv, ekskrementer eller andre former for modellen husly lave niveauer af smitteevne. RT-QuIC absolut giver fordele i forhold til andre assays reproducerbarhed, praktiske, hurtighed (mindre end 50 h) og lave omkostninger i forhold til bioassays. Den undgår de tekniske kompleksitet som sonikering bruges i PMCA; også, det er udført i en tape-forseglet mikrotiterplade, der minimerer risikoen for aerosol kontaminering af hver brønd. Formatet multi godt muliggør analysen af op til 96 prøver i det samme eksperiment. For at imødegå de tilbagevendende problem af falske positiver og spontan omdannelse af rPrP i in vitro- konvertering assays er gennemførelsen af en tærskel (cut-off) i RT-QuIC meget nyttig. Faktisk, baseret på resultaterne af den negative kontrol (gennemsnitlig RFU negative prøver + 5 SD 27), en baseline er sat op som forskelsbehandling mellem positive og negative prøver kan gøres. Brugen af fire flergangsbestemmelser for hver prøve kan således bidrage til at definere en prøve som positiv, når mindst 50% af replikater viser et positivt signal, krydser dvs cut-off 28. Homologi mellem frø og substrat er ikke påkrævet i RT-QuIC, som f.eks. i en tidligere undersøgelse, hamster rPrP fandtes at være mere følsomme substrat i forhold til den homologe substrat i menneskelige PrPvCJD seedede og får scrapie seedede reaktioner 29. hamster-får kimære rPrP foreslog også for at være et mere velegnet substrat end menneskelige rPrP at opdage menneskelige variant Creutzfeldt-Jakobs sygdom prioner 30. Således er brug af rPrP substrater fra forskellige arter meget almindelige i dette assay. Denne analyse har været anvendt med succes til flere prionsygdomme, såsom sporadisk CJD 31,32,33, genEtic prion sygdomme 34, BSE 35,36,37, scrapie 23,36og CWD 38,39,40,41, 42. Undersøgelser, behandles cerebrospinalvæske, blod, spyt og urin som frø i RT-QuIC lykkedes alle at opdage PrPSc 38,39,40,41, 42. fremme opdagelse evne i prøver såsom blodplasma, der kan indeholde hæmmere af amyloid dannelse, Orrú mfl. (2011) udviklet en strategi for at fjerne potentielle hæmmere af amyloid dannelsen af kæmning PrPSc immunoprecipitation (IP) trin og RT-QuIC, opkaldt “forbedret QuIC” assay (eQuIC). Derudover var et substrat udskiftning trin ansat efter ~ 24 h af reaktionstid for at forbedre følsomheden. I sidste ende, som lavt som 1 ag af PrPSc var påvises ved eQuIC 30.

For at rense afføring ekstrakter og fjerne mulige assay hæmmere i afføring, blev fækal prøver i prækliniske og kliniske faser fra elg ved eksperimentel oral infektion homogeniseret i buffer der indeholder vaske-og rengøringsmidler og proteasehæmmere. Afføring ekstrakter indkom yderligere til forskellige metoder til at koncentrere PrPSc i prøverne udnytte protein nedbør via natrium phosphorwolfram syre (NaPTA) nedbør. Metoden NaPTA nedbør, første gang beskrevet af Safar et al. 43, der bruges til at koncentrere PrPSc i analyseprøverne. Inkubation af NaPTA med prøveresultater i præferentielle udfældning af PrPSc snarere end PrPC. Den molekylære mekanisme er imidlertid stadig uklart. Dette trin også hjulpet indeholdende og forhindre spontan omdannelse af rPrP, som er observeret i nogle tilfælde. Endelig, afføring ekstrakter blev testet af optimeret RT-QuIC ved hjælp af musen rPrP (aa 23-231) som substrat og herunder substrat udskiftning i protokollen at forbedre følsomheden af påvisning.

Resultaterne her vise, at denne forbedrede metode kan registrere meget lave koncentrationer af CWD prioner og øger følsomheden af påvisning og specificitet i fecal prøver i forhold til en protokol uden NaPTA nedbør og substrat udskiftning. Denne metode potentielt kan anvendes til andre væv og legemsvæsker og kan være til stor nytte for CWD overvågning i vilde og fangenskab hjortedyr.

Protocol

1. RT-QuIC ved hjælp af fækal materiale udarbejdelse af cervid afføring udtrækker gøre fækal homogenatet ved at tilføje 1 g fecal materiale til 10 mL af afføring uddrag buffer (20 mM natriumfosfat, pH 7.1, 130 mM NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF og 1 x komplet proteasehæmmere, EDTA-fri) at give en endelig koncentration på 10% (w/v). Homogenisering bufferen kan forberedt inden udnyttelsen og opbevares ved -20 ° C. Homogenize fækal pellets (1 g) og buffer (10 mL) i …

Representative Results

CWD fækal ekstrakter forberedt på 10% (w/v) var i stand til frø RT-QuIC reaktion, men følsomheden af påvisning var lav 27. Ved hjælp af en specifik buffer for fækal homogenisering var et afgørende skridt til at undgå høje baggrund fluorescens i RT-QuIC reaktioner samtidig brug af musen rPrP substrat i stedet for deer rPrP, som gjorde det muligt for at få mere specifikke resultater 27. Tilsætning af NaPTA nedbør reduceret spontan…

Discussion

RT-QuIC var tidligere ansat til at opdage CWD prioner i urin og fækal ekstrakter mundtligt inficerede hvide – tailed hjorte og mule deer 38. Systemet vist i dette håndskrift er en tilpasset metode af RT-QuIC analysen. Yderligere trin blev indarbejdet i den “klassiske” RT-QuIC assay at forbedre afsløring og følsomhed af analysen for CWD prioner i fecal materiale af inficerede dyr.

Lav følsomheden af påvisning i afføring ekstrakter førte os til forbedring af RT-Qu…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi er taknemmelige for Dr. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain laboratorier) for at give uddannelses- og cervid PrP bakteriel udtryk plasmid. SG understøttes af programmet Canada forskning stol. Vi anerkender, at finansiering af denne forskning til SG fra genom Canada, Alberta Prion Research Institute og Alberta landbrug og skovbrug gennem genom Alberta, og University of Calgary til støtte for dette arbejde. Vi anerkender forskning tilskud fra Margaret Gunn Foundation for Animal forskning.

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image