En temps réel Quaking induite par le test de Conversion pour détection de CWD Prions dans les matières fécales
Summary
Nous présentons ici un protocole pour décrire une technique d’amplification de prion simple, rapide et efficace, la méthode de conversion induite par le tremble en temps réel (RT-QuIC).
Abstract
La technique RT-QuIC est sensibles in vitro acellulaires prion amplification basée principalement sur le mauvais repliement épépiné et l’agrégation de substrat protéique (PrP) de prion recombinante graines prion en utilisant comme modèle pour la conversion. RT-QuIC est une nouvelle technique de haut débit qui est analogue au Real Time polymerase chain reaction (PCR). Détection de la croissance de fibrilles amyloïdes est basée sur la teinture thioflavine T, qui produit une fluorescence lors de l’interaction spécifique avec les riches protéines ᵦ-feuille. Ainsi, la formation d’amyloides peut être détectée en temps réel. Nous avons tenté de développer un test de dépistage non-invasif fiable pour détecter les prions de la maladie (MDC) dépérissement chronique extrait fécale. Ici, nous avons spécifiquement adapté la technique RT-QuIC pour révéler la PrPSc ensemencement d’activité dans les excréments de cervidés infectés de cervidés. Au départ, l’activité ensemencement des selles extraits que nous préparé a été relativement faible en RT-QuIC, probablement à cause d’inhibiteurs potentiels de dosage dans les matières fécales. Pour améliorer l’activité ensemencement d’extraits de matières fécales et supprimer les inhibiteurs potentiels de dosage, nous avons homogénéisé les échantillons les dans une mémoire tampon contient des détergents et des inhibiteurs de la protéase. Aussi, nous avons soumis les échantillons à différentes méthodes pour se concentrer sur la base de la précipitation de protéines à l’aide de sodium acide phosphotungstique et force centrifuge la PrPSc . Enfin, les extraits de matières fécales ont été testés par optimisé RT-QuIC qui comprenait le remplacement de substrat dans le protocole pour améliorer la sensibilité de détection. Ainsi, nous avons établi un protocole pour la détection sensible du prion CWD ensemencement d’activité dans les excréments de cervidés pré-cliniques et cliniques par RT-QuIC, qui peut être un outil pratique pour le diagnostic non invasif de DLG.
Introduction
Les maladies à prions ou encéphalopathies spongiformes transmissibles (est) sont des maladies neurodégénératives comme la maladie de Creutzfeldt – Jakob (SCJ) chez l’homme, encéphalopathie spongiforme bovine (ESB) chez les bovins, la tremblante chez les ovins et les caprins et gaspillage chronique maladie (CWD) chez les cervidés 1,2. Est se caractérisent par l’aspect distinctif spongiforme et la perte de neurones dans le cerveau. Selon l’hypothèse de « protéine seule », prions sont principalement composées de PrPSc (« Sc » pour la tremblante) 3, une isoforme forme anormale de la protéine prion cellulaire hôte codé, PrPC. PrPSc résulte de la conversion de la PrPC dans une conformation enrichie en ᵦ-feuilles 4,5,6 , qui peut agir comme une graine de lier et de convertir les autres molécules PrPC . Les molécules nouvellement créées de la PrPSc sont incorporés dans un croissant polymère 7,8 , qui se brise en petits oligomères, résultant en plus grand nombre de noyaux infectieuses. PrP-Sc est sujette à l’agrégation et est partiellement résistante aux protéases 9,10.
CWD affecte sauvages et d’élevage de wapiti (Cervus canadensis), le cerf mulet (Odocoileus hemionus), le cerf de Virginie (WTD ; Odocoileus virginianus), l’orignal (Alces alces) et le renne (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Il est considéré comme la plus contagieuse maladie à prions avec transmission horizontale, favorisée par des interactions de cervidés et de persistance dans l’environnement de l’infectivité 14,15. Contrairement à d’autres maladies à prions, où l’accumulation de PrPSc et l’infectiosité sont confinés au cerveau, gros débris ligneux ceux-ci sont également présents dans les tissus périphériques et les liquides organiques par exemple salive, l’urine et fèces 16,17, 18.
Immunohistochemistry est considéré comme l’étalon-or pour le diagnostic de la DLG détecter les PrPSc distribution et spongiforme lésions 19,20. ELISA et dans de plus rares cas, la tache occidentale sont également utilisés pour le diagnostic de DLG. Ainsi, diagnostic des maladies à prions actuelle repose essentiellement sur la détection des prions dans les tissus post-mortem. Diagnostic ante-mortem CWD est disponible en prenant des amygdales ou des biopsies de tissu lymphoïde associé aux muqueuses recto-anal (test RAMALT) ; Toutefois, cette procédure est invasive et nécessite la capture des animaux. Ainsi, l’utilisation de spécimens facilement accessibles, tels que l’urine et les selles, serait une façon pratique pour la détection du prion CWD. Toutefois, le port de ces excréments des concentrations relativement faibles de prions inférieure au seuil de détection des méthodes actuelles de diagnostic. Par conséquent, un outil de diagnostic de débit plus sensible et plus élevée est nécessaire. In vitro le systèmes de conversion, comme la protéine misfolding cyclique amplification assay (PMCA) 21, amyloïde ensemencement dosage et conversion induite par le tremble en temps réel (RT-QuIC) dosage 22,23, 24 sont des outils très puissants pour exploiter la capacité propageant des PrPSc à reproduire in vitro le processus de conversion de prion et ainsi amplifier la présence de quantités infimes de PrPSc à des niveaux détectables 25 ,26. La méthode RT-QuIC, cependant, tire parti du fait que le produit de conversion enrichi en feuillet β structure secondaire peut lier spécifiquement thioflavine T (Th-T). Par conséquent, PrP recombinante (PRPR) lors de la conversion ensemencée se développe en fibrilles amyloïdes qui se lient Th-T et peuvent ainsi être détectées en temps réel par la mesure de la fluorescence du Th-T exprimée en unités (RFU) de la fluorescence relative au fil du temps. Une fois contrôlé, la RFU peut être utilisée pour évaluer les activités d’ensemencement relatives et paramètres quantitatifs tels que la phase de latence. La phase de latence représente le temps (h) requis pour atteindre le seuil, au cours de laquelle PRPR conversion dès les premiers stades de la réaction est inférieure au seuil de détection de la fluorescence de Th-T. La fin de la phase de latence apparente, concomitante à la formation d’un noyau amyloïde suffisante (nucléation/allongement), se produit lorsque la fluorescence Th-T dépasse le niveau de seuil et devient positive. La croissance de la substance amyloïde fibrilles peuvent être détectées en temps réel et de l’initiale PrPSc ou semie activité contenue dans l’échantillon est amplifiée par la segmentation qui génère plus de graines. Ces graines induisent à son tour une rapide phase exponentielle de croissance de fibres amyloïdes.
Parce que ce test est capable de détecter aussi bas que 1 fg des PrPSc 24, la haute sensibilité qualifie cette technique pour atteindre ante mortem ou diagnostic non invasif en détectant les PrPSc dans divers tissus périphériques, excréments ou autre types de spécimens ayant de faibles niveaux d’infectiosité. RT-QuIC constitue certainement avantages par rapport aux autres épreuves pour sa reproductibilité, praticité, rapidité (moins de 50 h) et de faibles coûts par rapport aux essais biologiques. Elle évite les complexités techniques comme la sonication utilisé dans PMCA ; en outre, il est pratiqué dans une microplaque ruban étanche qui minimise le risque de contamination des aérosols de chaque puits. Le format multipuit permet l’analyse des échantillons jusqu’à 96 dans la même expérience. Pour contrer le problème récurrent de faux positifs et de la conversion spontanée du PRPR dans les essais de conversion in vitro , la mise en œuvre d’un seuil (cut-off) en RT-QuIC est très utile. En effet, selon les résultats du contrôle négatif (RFU moyenne des échantillons négatifs + 5 SD 27), une ligne de base est mis en place d’où on peut faire la discrimination entre les échantillons positifs et négatifs. L’utilisation de quatre répétitions de chaque échantillon peut donc aider à définir un échantillon positif quand au moins 50 % des répliques montre un signal positif, c’est-à-dire franchir le seuil de 28. L’homologie entre les graines et le substrat n’est pas nécessaire dans le RT-QuIC, comme par exemple dans une étude antérieure, hamster PRPR a trouvé un substrat plus sensible par rapport au substrat homologue en humain PrPvMCJ épépiné et tremblante du mouton ensemencées réactions 29. hamster-moutons chimérique PRPR a également été suggéré d’être un substrat plus adapté que PRPR humain pour détecter des prions de MCJ variante humaine 30. Ainsi, l’utilisation de substrats PRPR provenant de différentes espèces est très fréquente dans ce test. Ce test a été appliqué avec succès à plusieurs maladies à prions, comme sporadique MCJ 31,32,33, genles maladies de prion ETIC 34, l’ESB 35,36,37, tremblante 23,36et CWD 38,39,40,41, 42. Des études utilisant traitement liquide céphalorachidien, sang, salive et urine comme graines à RT-QuIC étaient tous réussis pour détecter les PrPSc 38,39,40,41, 42. afin de favoriser la capacité de détection dans des échantillons tels que le plasma sanguin contenant des inhibiteurs de la formation d’amyloïde, Orrú et al. (2011) a élaboré une stratégie pour éliminer les inhibiteurs potentiels de formation amyloïde par peignage PrPSc immunoprécipitation (IP) étape et RT-QuIC, nommé « renforcée QuIC » test (eQuIC). En outre, une étape de remplacement de substrat a été employée après ~ 24 h temps de réaction afin d’améliorer la sensibilité. En fin de compte, comme bas que 1 ag du PrPSc a été détecté par eQuIC, 30.
Afin de purifier des extraits de matières fécales et d’éliminer les inhibiteurs de dosage possible dans les selles, les échantillons de matières fécales recueillis aux stades précliniques et cliniques de wapiti à l’infection expérimentale orale ont été homogénéisés dans un tampon contenant des détergents et des inhibiteurs de la protéase. Les extraits de matières fécales ont été davantage soumis à différentes méthodes pour concentrer les PrPSc dans les échantillons utilisant la précipitation de protéines par précipitation de sodium phosphotungstique acide (NaPTA). La méthode de précipitation de NaPTA, tout d’abord décrite par Safar al. 43, est utilisée pour concentrer le PrPSc dans les échantillons de test. L’incubation de NaPTA avec les résultats de l’échantillon dans les précipitations préférentielle de PrPSc plutôt PrPC. Toutefois, le mécanisme moléculaire est encore incertain. Cette étape a également aidé contenant et empêcher la conversion spontanée du PRPR, ce qui est observé dans certains cas. Enfin, les extraits de matières fécales ont été testés par optimisé RT-QuIC en utilisant la souris PRPR (aa 23-231) comme substrat et y compris le remplacement de substrat dans le protocole pour améliorer la sensibilité de détection.
Les résultats présentés ici montrent que cette méthode améliorée peut détecter des concentrations très faibles de prions CWD et augmente la sensibilité de détection et de spécificité dans les fèces par rapport à un protocole sans remplacement de précipitation et de substrat NaPTA. Potentiellement, cette méthode peut être appliquée à d’autres tissus et les fluides corporels et peut être d’une grande utilité pour la surveillance de la CWD chez les cervidés sauvages et en captivité.
Protocol
Representative Results
Discussion
RT-QuIC travaillait auparavant pour détecter des débris ligneux prions dans l’urine et les selles extraits de cerfs de Virginie et le cerf mulet oralement infecté 38. Le système indiqué dans ce manuscrit est une adaptation de la méthode de l’essai RT-QuIC. Des étapes supplémentaires ont été incorporées dans le test de RT-QuIC « classique » pour améliorer la détection et la sensibilité de l’essai pour prions CWD dans les matières fécales des animaux infectés.
<p class…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à m. Byron Caughey (NIH Rocky Mountain Laboratories) pour des formations et le plasmide bactérien expression de cervidés PrP. SG est pris en charge par le programme de la Chaire de recherche du Canada. Nous reconnaissons le financement de cette recherche au SG de Génome Canada, Alberta Prion Research Institute et ministère de l’Agriculture et la foresterie par Génome Alberta et l’Université de Calgary, à l’appui de ce travail. Nous reconnaissons une subvention de recherche de la Margaret Gunn Foundation for Animal Research.
Materials
| Materials | |||
| Acrodisc seringe filters | PALL | 4652 | |
| amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit | Millipore | UCF901024 | |
| BD 10 ml seringe | VWR | CA75846-842 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Corning bottle-top vacuum filters | Sigma-Aldrich | 431118 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| gentleMACS M Tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | ThermoFisher Scientific | 12780029 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| N2 supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 15502048 | |
| N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma-Aldrich | ML9150 | |
| Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K | PALL | OD100C34 | |
| Nunc sealing tapes | ThermoFisher Scientific | 232702 | |
| Parafilm M | VWR | 52858-000 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Protease inhibitor tablet | Roche | 4693159001 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Calbiochem | 7910-OP | |
| sodium phosphate | Sigma-Aldrich | 342483 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous | Sigma-Aldrich | S9763 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) | Sigma-Aldrich | 496626 | |
| Thioflavin T | Sigma-Aldrich | T3516 | |
| Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| Triton-100 | Calbiochem | 9410-OP | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Commercial buffers and solutions | |||
| BugBuster Master Mix | Nogagen | 71456-4 | |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 1018401 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) | Life Technoligies | P5493 | |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977015 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standards and commercial kits | |||
| Express Autoinduction System 1 | Novagen | 71300-4 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment setup | |||
| AKTA protein purification systems FPLC | GE Healthcare Life Sciences | ||
| Beckman Avanti J-25 Centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-25.50 | Beckman Coulter | ||
| Beckman rotor JA-10 | Beckman Coulter | ||
| FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sofware | |||
| MARS Data Analysis | BMG Labtech | ||
| GraphPad Prism6 | GraphPad software |
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