실시간 떨게 유발 CWD Prions 지저분한 자료의 검색을 위한 변환 분석 결과

Summary

여기, 우리는 간단, 신속 하 고 효율적인 프리온 증폭 기술, 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 메서드를 설명 하는 프로토콜을 제시.

Abstract

RT QuIC 기술은 민감한 생체 외에서 셀 무료 프리온 증폭 분석 결과 기반으로 주로 시드 misfolding 및 변환에 대 한 템플릿으로 프리온 씨앗을 사용 하 여 재조합 프리온 단백질 (PrP) 기판의 집계입니다. RT QuIC는 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)는 소설 높은 처리 기술입니다. 녹말 체 fibril 성장의 감지 염료 ᵦ 시트 풍부한 단백질의 특정 상호 작용에 따라 fluoresces Thioflavin T를 기반으로 합니다. 따라서, 녹말 체 형성을 실시간으로 검색할 수 있습니다. 우리는 지저분한 추출 만성 낭비 질병 (CWD) prions를 검출 하기 위하여 신뢰할 수 있는 비-침략 적 선별 검사를 개발 하려고 결정 했습니다. 여기, 우리가 구체적으로 PrP^Sc 시드 CWD의 배설물에는 활동 감염 cervids 공개 RT QuIC 기술을 적응 시켰다. 처음에, 우리가 준비 배설물 추출의 시드 활동 상대적으로 낮은 RT QuIC 배설물 소재에 잠재적인 분석 결과 억제제 때문에 가능 하 게 했다. 대변 추출의 시드 활동 향상과 잠재력 분석 결과 억제제를 제거, 우리는 세제와 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 버퍼에 배설물 샘플 무 균. 우리는 또한 PrP 단백질 강 수 나트륨 phosphotungstic 산, 및 원심력을 사용 하 여 기준^Sc 집중 다른 방법론에 샘플을 제출. 마지막으로, 배설물 추출 최적화 된 RT-QuIC 탐지의 감도 향상 시키기 위해 프로토콜에 기판 교체를 포함 하 여 테스트 되었습니다. 따라서, 우리는 시드 여 RT-QuIC, 비-침략 적 CWD 진단에 대 한 실용적인 도구가 될 수 있는 전 임상 및 임상 cervids의 배설물에서 활동 하는 CWD 프리온의 민감한 감지에 대 한 프로토콜을 설립.

Introduction

프리온 질병 또는 전송 가능 해 encephalopathies (TSE) 인간, 소 면 뇌 질환 (BSE) 가축, 양, 염소, 그리고 만성 낭비 scrapie에에서 크로이츠펠트-야콥 병 (CJD)를 포함 한 신경 퇴행 성 장애는 질병 (CWD) cervids ^1,2. TSEs 독특한 면 모양 및 두뇌에서 뉴런의 손실에 의해 특징. “단백질만” 가설에 따르면 prions PrP^Sc (‘Sc’ scrapie에 대 한) ³, 호스트 인코딩 세포 프리온 단백질, PrP^C의 misfolded isoform의 주로 구성 됩니다. PrP^Sc 구조 바인딩할 다른 PrP^C 분자를 변환 하는 씨앗 역할을 할 수 있는 ᵦ 시트 ^4,,56 농축에 PrP^C 의 변환에서 유래한 다. 새로 생성 된 PrP^Sc 분자는 성장 폴리머 ^7,8 작은 올리고, 전염 성 핵의 더 높은 숫자의 결과로 침입에 통합 됩니다. PrP^Sc 집계 하는 경향이 고은 부분적으로 프로 테아 제 ^9,10.

CWD 야생과 농장 엘크 (Cervus 카 나 덴 시스), 사슴 (Odocoileus hemionus), 흰 꼬리 사슴 (WTD; 영향을 Odocoileus virginianus), 사슴 (Alces alces), 그리고 순 록 (Rangifer tarandus tarandus) ^11,,1213. Cervid 상호 작용 및 infectivity ^14,15의 환경 지 속성에 의해 선호 하는 수평 전송 가장 전염 성 프리온 질병을 여겨진다. PrP^Sc 축적과 infectivity 뇌에 수감 된다 다른 프리온 질병과는 달리 CWD에 이들은 또한 발견 된다 주변 조직과 체액에서 예 타 액, 소변, 대변 ^{16,17, 18}.

Immunohistochemistry는 PrP^Sc 분포 및 발생 병 변 ^19,20감지 하 CWD 진단에 대 한 황금 표준으로 간주 됩니다. ELISA 더 드문 경우에, 서쪽 오 점 CWD 진단을 위해 사용 됩니다. 따라서, 현재 프리온 질병 진단 주로 기반으로 사후 조직에 prions를 감지 합니다. 편도 또는 recto 항문 점 막 관련 림프 조직 (RAMALT) 생 검; 여 CWD에 대 한 축전 진단이 이다 그러나,이 절차는 침략 하며 동물의 캡처. 따라서, 소변, 대변, 등 쉽게 접근할 수 있는 견본의 사용 CWD 프리온 검출을 위한 실용적인 방법 것입니다. 그러나, 그 배설물 하버는 상대적으로 현재 진단 방법의 검출 한계 아래 prions의 농도가 낮은. 따라서, 더 과민 하 고 높은 처리량 진단 도구는 필요 합니다. 생체 외에서 변환 시스템, 순환 증폭 misfolding 단백질 분석 결과 (PMCA) ²¹, 아 밀 로이드 시드 분석 결과, 그리고 실시간 떨게 유발 변환 (RT-QuIC) 분석 결과 ^{22,23, 24} 는 매우 강력한 도구를 프리온 변환 프로세스 생체 외에서 모방을 PrP^Sc 의 자체 전파 기능을 악용 하 고 그로 인하여 감지 레벨 ^{25에 PrPSc 의 총계의 존재를 증폭 ,26}. 그러나 RT QuIC 방법, 활용 사실 β 시트 보조 구조에서 농축 변환 제품 특히 thioflavin T (Th-T)를 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 시드 변환 시 재조합 형 PrP (rPrP)는 Th-T를 바인딩할 및 따라서 Th-T 시간이 지남에 상대적 형광 단위 (RFU)로 표현의 형광을 측정 하 여 실시간으로 검출 될 수 있는 녹말 체 소에 자 랍니다. 모니터링, 일단 상대 시드 활동, 그리고 지연 위상 등 양적 매개 변수를 평가 하는 RFU는 사용할 수 있습니다. 래그 단계는 rPrP 동안 반응의 초기 단계에서 변환 Th-T 형광의 탐지 한계 아래는 임계값에 도달 하는 데 필요한 시간을 (h)를 나타냅니다. 충분 한 녹말 체 핵 (nucleation/신장)의 형성을 수 반하는 명백한 지연 위상의 끝에는 Th-T 형광 임계값 수준을 초과 긍정적인 됩니다 때 발생 합니다. 소는 실시간으로 초기 PrP^Sc 또는 샘플에 포함 된 시드 활동에서 검출 될 수 있다 아 밀 로이드의 성장은 더 많은 씨를 생성 하는 시장 세분화에 의해 증폭 된다. 이 씨는 차례 차례로 녹말 체 섬유 성장의 급속 한 지 수 단계를 유도.

이 분석 결과 1 최저 감지할 수 있기 때문에 PrP^{사우스 캐롤라이나 24}의 fg, 높은 감도 자격이 기술을 다양 한 주변 조직, 배설물 등에서 PrP^Sc 를 감지 하 여 안 테 부검 또는 비-침략 적 진단을 달성 하 표본 infectivity의 저급을 은닉의 종류입니다. RT QuIC 확실히 이점을 제공 한다 다른 분석 실험의 재현성, 실용성, 신속성 (50 시간 미만) 및 생물 검정에 비해 낮은 비용에 대 한. 그것은 쥡니다 PMCA;에 사용 등 기술적인 복잡성 방지 또한, 그것은 각의 어로 졸 오염 위험을 최소화 하는 테이프 봉인 microplate에 수행 됩니다. 다 잘 형식 같은 실험에서 최대 96 샘플의 분석을 수 있습니다. 잘못 된 반응의 재발 문제 및 생체 외에서 변환 분석에서 rPrP의 자발적인 변환에 대응 하기 위해 임계값 (컷오프)에서 RT-QuIC의 구현을 매우 유용 합니다. 실제로, 부정적인 컨트롤 (평균 RFU의 부정적인 샘플 + 5 SD ²⁷)의 결과에 따라, 초기 계획 설정 됩니다는 긍정적이 고 부정적인 샘플 사이 차별을 할 수 있습니다. 각 샘플에 대 한 4 개의 복제를 사용 하 여 수 있습니다 따라서는 복제의 50% 이상에서 긍정적인 신호를 표시 하는 때 긍정적으로 샘플을 정의 하는 데 도움이 됩니다, 즉, 교차 하는 절단 ²⁸. 예: 이전 연구에서 햄스터 rPrP는 발견으로 인간의 PrP^vCJD 에 동종 기판에 비해 더 민감한 기판 하 시드 및 양 scrapie 시드 반응 ^{씨와 기판 사이의 homology RT QuIC에서 필요 하지 않습니다. 29}. 햄스터 양 공상 rPrP 또한 인간의 변종 CJD prions ³⁰감지 하 인간 rPrP 보다 더 적합된 기판 수를 제안 했다. 따라서, 다른 종에서 rPrP 기판의 사용이 분석이 결과에서 아주 일반적 이다. 이 분석 결과 산발적 CJD ^31,,3233, 겐 등 여러 프리온 질환에 성공적으로 적용 되었습니다.etic 프리온 질병 ³⁴, 광우병 ^35,,3637, scrapie ^23,36및 CWD ^{38,,3940,41, 42}. RT QuIC 씨앗 PrP^{Sc 38,,3940,41,} 감지 하 모두 성공 했다 연구를 사용 하 여 중추 신 경계, 전체 혈액, 타 액, 소변 처리 ⁴². 녹말 체 형성 억제제를 포함 될 수 있습니다 혈액 플라스마 등 샘플의 탐지 능력을 육성 하기 위해 Orrú 외. (2011) PrP^Sc immunoprecipitation (IP) 단계 및 RT-QuIC 빗질 하 여 녹말 체 형성의 잠재적인 억제제를 제거 하는 전략을 개발, “향상 된 QuIC” 분석 결과 (eQuIC) 라는. 또한, 기판 교체 단계 반응 시간 ~ 24 시간 후 감도 개량 하기 위하여 고용 되었다. 궁극적으로,로 1 PrP^Sc 의 ag eQuIC ³⁰에 의해 감지 되었다.

배설물 추출 정화 하 고 배설물에 가능한 분석 결과 억제제를 제거, 실험 구강 감염 시 엘크에서 전 임상 및 임상 단계에서 수집 된 배설물 샘플 세제와 프로 테아 제 억제제를 포함 하는 버퍼에서 무 균 했다. 대변 추출 추가 나트륨 phosphotungstic 산 (NaPTA) 강 수를 통해 단백질 강 수를 활용 하는 샘플에 PrP^Sc 를 집중 하는 다른 방법론에 제출 했다. NaPTA 강 수 방법, Safar 외. 에 의해 처음으로 설명 ⁴³, 테스트 샘플에 PrP^Sc 를 집중 하는 데 사용 됩니다. 샘플 NaPTA의 인큐베이션 PrP^C보다는 PrP^Sc 의 우선 강 수 발생합니다. 그러나, 분자 메커니즘이 아직 명확 하지 않습니다. 이 단계는 또한 포함 하 고 어떤 경우에 관찰 되는 rPrP의 자발적인 변환 방지 도움. 마지막으로, 배설물 추출 최적화 된 RT-QuIC 프로토콜에 기판 교체를 포함 하 여 기판으로 마우스 rPrP (aa 23-231)를 사용 하 여 탐지의 감도 향상 하 여 테스트 되었습니다.

여기 결과이 개선된 방법 CWD prions의 매우 낮은 농도 검출할 수 있다 검출 및 배설물 샘플 NaPTA 강 수와 기판 교체 없이 프로토콜에 비해 특이성의 감도 증가 보여줍니다. 이 메서드는 잠재적으로 다른 조직 및 체액에 적용할 수 있다 하며 CWD 감시 야생과 포로 cervids에 대 한 훌륭한 사용 될 수 있습니다.

Protocol

1. RT QuIC 사용 하 여 배설물 소재 배설물의 10 mL를 분 변 물질의 1 g를 추가 하 여 확인 cervid 배설물의 준비 추출 지저분한 homogenate 추출 버퍼 (20 m m 인산 나트륨, pH 7.1, 130 m m NaCl, 0.05% 트윈 20, 1 밀리미터 PMSF 및 1 x 완료 protease 억제제, EDTA 무료) 10% (w/v)의 최종 농도 주고. 균질 버퍼의 이용 전에 준비 하 고-20에 저장 수 있다 ° c. Homogenize 찌 끼 펠 릿 (1 g) 그리고 실내 ?…

Representative Results

CWD 지저분한 추출 물 10% (w/v)에서 RT-QuIC 반응, 씨앗 수 있었다 아직 검출의 감도 낮은 27. RT QuIC 반응에 수 반하는 사용에 마우스 rPrP 기판의 높은 배경 형광을 피하기 위해 중요 한 단계는 지저분한 균질에 대 한 특정 버퍼를 사용 하는 보다 더 구체적인 수 사슴 rPrP 결과 27. NaPTA 강 수의 추가 반응 (그림 2)의 시드 활?…

Discussion

RT QuIC 이전 고용 되었다 소변 및 배설물 추출 물 구두로 감염 된 흰 꼬리 사슴, 뮬 사슴 ³⁸의 CWD prions를 검출 하기 위하여. 이 원고에 표시 된 시스템 RT QuIC 분석 결과의 적응된 방법입니다. 추가 단계는 검색 및 CWD prions 감염된 동물의 분 변 물질에 대 한 분석 결과의 감도 향상 시키기 위해 “클래식” RT QuIC 분석 결과에 통합 했다.

배설물 추출 물에서 낮은 감도 R…

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters	PALL	4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit	Millipore	UCF901024
BD 10 ml seringe	VWR	CA75846-842
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Corning bottle-top vacuum filters	Sigma-Aldrich	431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E4884
gentleMACS M Tube	Miltenyi Biotec	130-093-236
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	G4505
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615
Luria-Bertani (LB) broth	ThermoFisher Scientific	12780029
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M9272
N2 supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)	Sigma-Aldrich	ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K	PALL	OD100C34
Nunc sealing tapes	ThermoFisher Scientific	232702
Parafilm M	VWR	52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626
Protease inhibitor tablet	Roche	4693159001
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Calbiochem	7910-OP
sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)	Sigma-Aldrich	496626
Thioflavin T	Sigma-Aldrich	T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)	Sigma-Aldrich	T6066
Triton-100	Calbiochem	9410-OP
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix	Nogagen	71456-4
Ni-NTA superflow	Qiagen	1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)	Life Technoligies	P5493
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977015
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1	Novagen	71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC	GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge	Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50	Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10	Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader	BMG Labtech
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sofware
MARS Data Analysis	BMG Labtech
GraphPad Prism6	GraphPad software