Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Abstract

A técnica de RT-QuIC é um sensível em vitro príon celular livre amplificação ensaio baseado principalmente no semeado enrolamento e agregação de substrato de proteína (PrP) recombinante do prião usando sementes de príon como um modelo para a conversão. RT-QuIC é uma nova técnica de alta produtividade, que é análoga à reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). Deteção de crescimento de amiloide fibrila baseia-se o corante Thioflavin T, que fluoresce a mediante interação específica com proteínas ricas ᵦ-folha. Assim, a formação de amiloide pode ser detectada em tempo real. Procurou-se desenvolver um teste de rastreio não-invasiva confiável para detectar os príons de doença (CWD) desperdiçando crônica no extrato fecal. Aqui, nós adaptamos especificamente a técnica de RT-QuIC revelará o PrP^Sc semeadura atividade nas fezes de CWD infectado cervídeos. Inicialmente, a atividade de propagação dos extratos fecais que estamos preparados foi relativamente baixa em RT-QuIC, possivelmente devido a potenciais inibidores de ensaio no material fecal. Para melhorar a atividade de preparação de extratos de fezes e remover potenciais inibidores de ensaio, nós homogeneizado as amostras fecais em um buffer que contém detergentes e inibidores de protease. Também apresentámos as amostras de diferentes metodologias para concentrar o PrP^Sc com base na precipitação de proteínas usando ácido fosfotúngstico de sódio e força centrífuga. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC que incluiu a substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção. Assim, estabelecemos um protocolo para a deteção sensível de príons CWD semeadura atividade nas fezes de cervídeos pré-clínicos e clínicos por RT-QuIC, que pode ser uma ferramenta prática para o diagnóstico não-invasivo de CWD.

Introduction

Doenças do prião ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Creutzfeldt – Jakob (CJD) em humanos, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, tremor epizoótico dos ovinos e caprinos e desperdiçando crônica doença (CWD) em cervídeos ^1,2. EET caracterizam-se pela aparência distintiva espongiforme e perda de neurônios do cérebro. De acordo com a hipótese de “proteína apenas”, príons são principalmente compostos de PrP^Sc (‘Sc’ para o tremor epizoótico) ³, uma isoforma misfolded da proteína príon celular codificado anfitrião, PrP^C. PrP^Sc resulta da conversão de PrP^C em uma conformação enriquecida em ᵦ-folhas ^4,5,6 , que pode atuar como uma semente para vincular e converter outras moléculas de PrP^C . As moléculas de PrP^Sc recém-gerado são incorporadas em um crescente polímero ^7,,⁸ que invade oligômeros menores, resultando em maior número de núcleos infecciosos. PrP^Sc é propenso a agregação e é parcialmente resistente às proteases ^9,10.

CWD afeta alces selvagens e de criação (Cervus canadensis), veado (Odocoileus hemionus), cariacu (WTD; Odocoileus virginianus), alce (Alces alces) e Rena (Rangifer tarandus tarandus) ^11,12,13. É considerada a mais contagiosa doença de Creutzfeld-Jacob com transmissão horizontal favorecido por cervídeos provenientes interações e persistência ambiental de infecciosidade ^14,15. Ao contrário de outras doenças de príon onde PrP^Sc acumulação e infecciosidade estão confinados ao cérebro, em CWD estas também são encontradas em tecidos periféricos e fluidos corporais, por exemplo, saliva, urina e fezes ^{16,17, 18}.

Imuno-histoquímica é considerada o padrão-ouro para o diagnóstico CWD detectar a distribuição de PrP^Sc e espongiforme lesões ^19,20. ELISA e em casos mais raros, borrão ocidental também são usados para diagnóstico CWD. Assim, o atual diagnóstico de doença de príon é baseado principalmente na detecção de príons em tecidos post-mortem. Diagnóstico ante mortem por CWD está disponível por tirar as amígdalas ou biópsias de tecido linfoide associado a mucosa reto-anal (RAMALT); no entanto, este procedimento é invasivo e requer a captura dos animais. Assim, o uso de amostras facilmente acessíveis, tais como urina e fezes, seria uma maneira prática para a deteção de príons CWD. No entanto, esses harbor excreções relativamente baixa concentrações dos priões abaixo do limite de detecção dos métodos de diagnóstico atuais. Por conseguinte, uma ferramenta diagnóstica mais sensível e alta taxa de transferência é necessária. Em vitro sistemas de conversão, tais como proteína enrolamento amplificação cíclica do ensaio (PMCA) ²¹, amiloide semeadura do ensaio e conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC) ensaio ^{22,23, 24} são ferramentas muito poderosas para explorar a capacidade auto-propagação de PrP^Sc de imitar em vitro o processo de conversão de príon e, assim, ampliar a presença de quantidades minuciosas de PrP^Sc para níveis detectáveis ^{25 ,26}. O método de RT-QuIC, no entanto, tira proveito do fato de que o produto de conversão enriquecido em estrutura secundária de β-folha especificamente pode ligar thioflavin T (Th-T). Portanto, o PrP recombinante (rPrP) mediante conversão semeado cresce em amiloides que ligam Th-T e, portanto, podem ser detectados em tempo real através da medição de fluorescência do Th-T expressada em unidades de fluorescência relativo (RFU) ao longo do tempo. Uma vez controlada, a RFU pode ser usada para avaliar atividades de semeadura relativas e parâmetros quantitativos como a fase de retardo. A fase de retardo representa o tempo necessário para atingir o limiar, durante a qual rPrP conversão a fase inicial da reação é abaixo do limite de detecção de fluorescência Th-T (h). O fim da fase de aparente defasagem, concomitante à formação de um núcleo de amiloide suficiente (nucleação/alongamento), ocorre quando a fluorescência de Th-T excede o nível de limiar e torna-se positivo. O crescimento das fibrilas podem ser detectadas em tempo real e a inicial do PrP^Sc ou semeadura atividade contida na amostra de amiloide é amplificado por segmentação que gera mais sementes. Estas sementes, por sua vez induzem uma rápida fase exponencial de crescimento de fibra amiloide.

Porque este ensaio é capaz de detectar tão baixo quanto 1 fg de PrP^{Sc 24}, a alta sensibilidade qualifica esta técnica para conseguir ante mortem ou diagnóstico não-invasivo, detectando PrP^Sc em vários tecidos periféricos, excreções ou outros tipos de amostra, abrigando os baixos níveis de infecciosidade. RT-QuIC definitivamente fornece vantagens sobre outros ensaios para sua reprodutibilidade, praticidade, rapidez (menos de 50 h) e baixos custos em comparação com os bioensaios. Evita as complexidades técnicas tais como sonication usado em PMCA; Além disso, ela é realizada em uma microplaca de fita-selado que minimiza o risco de contaminação de aerossol de cada poço. O formato multi bem permite a análise de até 96 amostras no mesmo experimento. Para combater o problema recorrente de falsos positivos e conversão espontânea de rPrP nos ensaios de conversão em vitro , a implementação de um limiar (cut-off) em RT-QuIC é muito útil. De fato, baseado nos resultados do controlo negativo (RFU média de amostras negativas + 5 SD ²⁷), uma linha de base é configurada do qual seja possível discriminação entre amostras positivas e negativas. O uso de quatro repetições para cada amostra, portanto, pode ajudar a definir uma amostra como positivo quando pelo menos 50% de repetições a mostrar um sinal positivo, ou seja, cruzar o disco de corte ²⁸. A homologia entre Sementes e substrato não é necessária no RT-QuIC, como por exemplo, em um estudo anterior, hamster rPrP foi encontrado ser um substrato mais sensível em relação ao substrato homólogas em humanos PrP^vCJD semeado e tremor epizoótico ovelhas semeado reações ²⁹. hamster-ovelha quimérico rPrP sugeriu-se também para ser um substrato mais adequado do que rPrP humano para detectar CJD variante humana priões ³⁰. Assim, o uso de substratos rPrP de diferentes espécies é muito comum neste ensaio. Este ensaio tem sido aplicado com êxito a várias doenças de príon, como esporádicos DCJ ^31,32,33, gendoenças de príon ETIC ³⁴, BSE ^35,36,37, ^23,de tremor epizoótico³⁶e CWD ^{38,39,40,41, 42}. Estudos utilizando processados líquor, sangue, saliva e urina como sementes em RT-QuIC foram todos bem sucedidas para detectar PrP^{Sc 38,39,40,41, 42}. para fomentar a capacidade de deteção em amostras de plasma de sangue que podem conter inibidores da formação de amiloide, Orrú et al. (2011) desenvolveu uma estratégia para remover potenciais inibidores da formação de amiloide penteando PrP^Sc passo de imunoprecipitação (IP) e RT-QuIC, chamado “reforçada QuIC” ensaio (eQuIC). Além disso, uma etapa de substituição do substrato foi empregada após ~ 24 h de tempo de reação a fim de melhorar a sensibilidade. Em última análise, como baixa como 1 ag de PrP^Sc era detectável por eQuIC ³⁰.

Fim de extratos de fezes de purificar e remover inibidores possível ensaio nas fezes, amostras fecais coletadas em estágios pré-clínicos e clínicos de elk após infecção oral experimental foram homogeneizadas em tampão contendo detergentes e inibidores de protease. Os extratos de fezes mais foram submetidos a diferentes metodologias para concentrar o PrP^Sc nas amostras utilizando a precipitação de proteínas através da precipitação do sódio fosfotúngstico ácida (NaPTA). O método de precipitação de NaPTA, primeiramente descrito por Safar e col ⁴³, é usado para concentrar o PrP^Sc em amostras do teste. A incubação de NaPTA com a amostra resulta em precipitação preferencial do PrP^Sc ao invés de PrP^C. No entanto, o mecanismo molecular é ainda incerto. Esta etapa também ajudou a contendo e impedindo a conversão espontânea de rPrP, que é observado em alguns casos. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC usando rPrP rato (aa 23-231) como substrato e incluindo substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção.

Aqui os resultados demonstram que este método melhorado pode detectar concentrações muito baixas de príons CWD e aumenta a sensibilidade de detecção e especificidade em amostras fecais em comparação com um protocolo sem substituição de precipitação e substrato de NaPTA. Potencialmente, este método pode ser aplicado a outros tecidos e fluidos corporais e pode ser de grande utilidade para vigilância CWD em cervídeos, selvagens e em cativeiro.

Protocol

1. RT-QuIC usando Material Fecal preparação de cervídeos provenientes de fezes de extratos Make homogenate fecal pela adição de 1 g de material fecal para 10 mL de fezes Extraia buffer (fosfato de sódio de 20 mM, pH 7.1, 130 mM de NaCl, 0,05% Tween 20, 1 mM PMSF e 1x completam os inibidores de protease, EDTA-free) para dar uma concentração final de 10% (p/v). O buffer de homogeneização pode ser preparado antes da utilização e armazenado a -20 ° C. Homogenize pel…

Representative Results

Os extratos fecais CWD preparados em 10% (p/v) foram capazes de reação de RT-QuIC de sementes, ainda a sensibilidade da deteção era baixa 27. Usar uma reserva específica para homogeneização fecal foi um passo fundamental para evitar a fluorescência de fundo elevado em RT-QuIC reações concomitantes ao uso de substrato de rato rPrP ao invés de veado rPrP que permitiu para obter mais específico resulta 27. A adição de NaPTA precip…

Discussion

RT-QuIC anteriormente foi empregado para detectar os príons CWD em urina e fezes extractos de infectados oralmente cariacu e veado-mula ³⁸. O sistema mostrado neste manuscrito é um método adaptado do ensaio QuIC-RT. Etapas adicionais foram incorporadas o ensaio de RT-QuIC “clássico” para melhorar a detecção e a sensibilidade do ensaio para príons CWD em material fecal de animais infectados.

A baixa sensibilidade da deteção em extractos de fezes nos levou para o…

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters	PALL	4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit	Millipore	UCF901024
BD 10 ml seringe	VWR	CA75846-842
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
Corning bottle-top vacuum filters	Sigma-Aldrich	431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E4884
gentleMACS M Tube	Miltenyi Biotec	130-093-236
Guanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	G4505
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513
Isopropanol	Sigma-Aldrich	I9516
Kanamycin sulfate	Sigma-Aldrich	60615
Luria-Bertani (LB) broth	ThermoFisher Scientific	12780029
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M9272
N2 supplement (100X)	ThermoFisher Scientific	15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl)	Sigma-Aldrich	ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K	PALL	OD100C34
Nunc sealing tapes	ThermoFisher Scientific	232702
Parafilm M	VWR	52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626
Protease inhibitor tablet	Roche	4693159001
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S3014
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Calbiochem	7910-OP
sodium phosphate	Sigma-Aldrich	342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA)	Sigma-Aldrich	496626
Thioflavin T	Sigma-Aldrich	T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris)	Sigma-Aldrich	T6066
Triton-100	Calbiochem	9410-OP
Tween 20	Sigma-Aldrich	P7949
Name	Company	Catalog Number	Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix	Nogagen	71456-4
Ni-NTA superflow	Qiagen	1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X)	Life Technoligies	P5493
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977015
Name	Company	Catalog Number	Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1	Novagen	71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23227
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC	GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge	Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50	Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10	Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader	BMG Labtech
gentleMACS Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sofware
MARS Data Analysis	BMG Labtech
GraphPad Prism6	GraphPad software