JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Реальном времени дрожат индуцированной Assay преобразования для обнаружения CWD прионов в фекалии

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/56373
, , , , ,
1Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine,University of Calgary, 2Dept. of Molecular Biology,University of Wyoming, 3Canadian Food Inspection Agency,Lethbridge Laboratories

Summary

Здесь мы представляем протокол для описания простой, быстрой и эффективной прионных амплификации метод, метод реального времени дрожат индуцированной преобразования (RT-QuIC).

Abstract

RT-QuIC техника относится чувствительных в пробирке клеток бесплатно прионы амплификации основана главным образом на в сеяный сворачиванию и агрегации рекомбинантных прионных белков (PrP) субстрата с помощью прионных семена как шаблон для преобразования. RT-QuIC является роман техника высокой пропускной способности, которая аналогична реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР). Обнаружение амилоида фибриллярных роста на основе красителя Тиофлавин Т, которая флуоресцирует на специфическое взаимодействие с богатой белками ᵦ-лист. Таким образом амилоидных формирования могут быть обнаружены в режиме реального времени. Мы попытались разработать надежный неинвазивные скрининг-тест для выявления хронической тратить прионов болезни (CWD) в фекальных экстракт. Здесь мы специально адаптированных RT-QuIC техника раскрыть что PrPSc посева деятельность в фекалиях CWD инфицирован оленей. Первоначально посева деятельность фекальных экстрактов, которые мы подготовили был относительно низким в RT-QuIC, возможно из-за потенциальных ингибиторов пробирного в фекалии. Чтобы улучшить деятельность посева Кала экстрактов и удалить потенциальных ингибиторов пробирного, мы гомогенизированные фекальных проб в буфер, содержащий моющих средств и ингибиторов протеазы. Мы также представили образцы различных методологий сконцентрироватьSc PrP на основе белков осадков с использованием натрия фосфорвольфрамовой кислоты и центробежной силы. Наконец экстракты фекалии были протестированы оптимизированный RT-QuIC которая включала замену субстрата в протоколе улучшить чувствительность обнаружения. Таким образом мы создали протокол для чувствительных обнаружения CWD прионных посева деятельность в фекалиях доклинических и клинических оленей по RT-QuIC, который может быть практическим инструментом для неинвазивной диагностики CWD.

Introduction

Прионы заболеваний или трансмиссивные формы губкообразной энцефалопатии (TSE) являются нейродегенеративных расстройств, включая болезни Крейтцфельда – Якоба (CJD) в организме человека, губчатой энцефалопатией (BSE) крупного рогатого скота, почесуха овец и коз и хронической тратить болезнь (CWD) в оленей 1,2. ТГЭ характеризуются отличительной губкообразная внешний вид и потери нейронов в головном мозге. Согласно гипотезе «только белок» прионы главным образом состоят из ОТРSc («Sc» для почесуха) 3, смятых изоформы хост кодировке сотовой прионных белков, ОТРC. PrPSc является результатом преобразования ОТРC в конформации, обогащенный ᵦ-листы 4,5,6 , который может выступать в качестве семян для привязки и преобразования других молекул PrPC . Созданное молекулы PrPSc включены в растущей 7,полимерных8 который разбивается на небольшие олигомеров, что приводит к росту числа инфекционных ядер. PrPSc склонной к агрегации и частично устойчив к протеаз 9,10.

CWD влияет на диких и выращиваемых лося (Cervus canadensis), mule олени (рода hemionus), белохвостый олень (WTD; Виргинский рода), лося (Alces alces) и олень (Rangifer tarandus tarandus) 11,12,13. Он считается наиболее заразных болезней китовая птичка с горизонтальной передачи cervid взаимодействия и экологической устойчивости инфективности 14,15. В отличие от других прионных заболеваний, где PrPSc накопления и инфективности приурочены к мозгу в ухо они также находятся в периферических тканях и жидкостях организма например слюна, моча и фекалии 16,17, 18.

Иммуногистохимия считается золотым стандартом для CWD диагностики для обнаружения PrPSc распределения и губчатые поражения 19,20. ELISA и в более редких случаях, Западная помарка также используются для диагностики CWD. Таким образом текущие диагноз болезни прионных главным образом основывается на выявлении прионов в тканях трупа. Ante-mortem диагноз для CWD доступен, принимая миндалин или биопсии ректо анальный слизистой оболочки связанных лимфоидной ткани (RAMALT); Однако эта процедура является инвазивным и требует захвата животных. Таким образом легко доступных образцов, таких как моча и фекалии, будет использоваться практический способ обнаружения CWD китовая птичка. Однако эти экскременты гавань относительно низкие концентрации прионов ниже предела обнаружения текущих методов диагностики. Следовательно необходима более чувствительной и высокой пропускной способности диагностический инструмент. В vitro преобразования систем, таких как белок, сворачиванию циклических усиления анализа (PMCA) 21, амилоид посева пробирного и реальном времени дрожат индуцированной преобразования (RT-QuIC) пробирного 22,23, 24 являются очень мощными инструментами для использования самостоятельного размножения ОТРSc способность имитировать в vitro процесс преобразования китовая птичка и тем самым усилить присутствие мизерных количествахSc PrP к обнаружению уровней 25 ,26. RT-QuIC метод, однако, использует тот факт, что преобразование продукт, обогащенный в вторичной структуре β-лист конкретно можно привязать Тиофлавин Т (Th-T). Таким образом рекомбинантных ОТР (rPrP) после преобразования в сеяный перерастает в амилоидных фибрилл, которые связывают Th-T и таким образом могут быть обнаружены в реальном времени путем измерения флуоресценции Th-T выражается относительной флуоресценции единиц (РФС) со временем. После того, как мониторинг, РФС может использоваться для оценки относительной посева мероприятия и количественные параметры, такие как лаг-фазы. Лаг-фаза представляет собой время (h) требуется достичь порога, во время которого rPrP преобразования на ранней стадии реакции находится ниже предела обнаружения Th-T флуоресценции. Конец этапа явное отставание, сопутствующие формирования достаточного амилоида ядра (нуклеации/удлинение), происходит, когда Th-T флуоресценции превышает пороговый уровень и становится положительным. Рост амилоида, которую фибриллами могут быть обнаружены в реальном времени и первоначальный PrPSc или заполнения деятельности, содержащихся в образце усиливается сегментации, которая генерирует больше семян. Эти семена в свою очередь вызывают быстрое экспоненциальной фазе роста амилоида волокна.

Потому что этот assay может обнаружить как низко как 1 fg ОТРSc 24, высокая чувствительность квалифицирует эту технику для достижения ante mortem или неинвазивной диагностики путем обнаружения PrPSc в различных периферийных тканей, экскременты или других виды образцов, укрывательство низкий уровень инфекционности. RT-QuIC определенно имеет преимущества перед другими анализов его воспроизводимости, практичности, быстрота (менее 50 h) и низкие расходы по сравнению с bioassays. Это позволяет избежать технические сложности, такие как sonication, используемые в PMCA; Кроме того она выполняется в запечатанные лентой микроплиты, которая минимизирует риск загрязнения аэрозоля каждой скважины. Несколько хорошо формат позволяет анализ образцов до 96 в том же эксперименте. Для противодействия периодические проблемы ложных срабатываний и спонтанное преобразования rPrP в конверсии в vitro анализов осуществление порог (отсечения) в RT-QuIC является очень полезным. Действительно основываясь на результатах отрицательного контроля (средняя РФС негативные примеры + 5 SD 27), базовый создан из которого может осуществляться дискриминация между положительным и отрицательным образцы. Использование четырех репликация для каждого образца таким образом может помочь определить образец как позитивные, когда по меньшей мере 50% реплицирует показывают позитивный сигнал, т.е. крест отсечения 28. Гомологии между семенем и субстрат не требуется в RT-QuIC, как например в предыдущем исследовании, хомячок rPrP был найден, чтобы быть более чувствительным субстрата, по сравнению с гомологичных субстрата в человека PrPвБКЯ семенами и скрепи овец посеян реакции 29. Хомяк овец химерных rPrP было также предложено быть подложке более подходящим чем человека rPrP обнаружить человека вариант CJD прионов 30. Таким образом использование rPrP субстратов из различных видов является очень распространены в этот assay. Этот assay был успешно применен к несколько прионных заболеваний, таких как спорадические CJD 31,,3233, генэтический прионных заболевания 34, BSE 35,,3637, почесуха 23,36и CWD 38,,3940,41, 42. Исследования с использованием обработанных спинномозговой жидкости, цельной крови, слюны и мочи, как семена в RT-QuIC все удалось обнаружить PrPSc 38,,3940,41, 42. для укрепления способности обнаружения в пробах как плазмы крови, которая может содержать ингибиторы амилоида формирования, Orrú и др. (2011) разработала стратегию для удаления потенциальных ингибиторов амилоида формирования расчесывать PrPSc иммунопреципитации (IP) шаг и RT-QuIC, под названием «расширение QuIC» проба (eQuIC). Кроме того замена шаг субстрата работал после ~ 24 h время реакции для того, чтобы улучшить чувствительность. В конечном итоге, как низко как 1 ag ОТРСК было обнаруживаемых eQuIC 30.

Чтобы очистить фекалии экстрактов и удалить возможные пробирного ингибиторы в фекалиях, фекальных пробах на доклинических и клинических стадиях лося на экспериментальной устные инфекции были гомогенизированные в буфер, содержащий моющих средств и ингибиторов протеазы. Фекалии экстракты далее были представлены различные методологии сконцентрировать PrPSc в образцах используя осадков белок через натрия фосфорвольфрамовой кислоты (NaPTA) осадков. Метод NaPTA осадков, впервые описан Сафар- et al. 43, используется сконцентрировать PrPSc в испытательных образцов. Инкубационный NaPTA с результатами выборки преференциальных осадков ОТРSc , вместо того, чтобы ОТРC. Однако молекулярный механизм до сих пор неясно. Этот шаг также помог сдерживания и предотвращения спонтанного преобразования rPrP, который наблюдается в некоторых случаях. Наконец экстракты фекалии были протестированы оптимизированный RT-QuIC с помощью rPrP (aa 23-231) мыши как субстрат и включая замену субстрата в протоколе улучшить чувствительность обнаружения.

Результаты здесь продемонстрировать, что этот усовершенствованный метод может обнаружить очень низких концентрациях CWD прионов и увеличивает чувствительность обнаружения и специфичность в фекальных пробах, по сравнению с протокол без осадков и субстрата замены NaPTA. Этот метод потенциально могут быть применены в других тканях и жидкостях организма и может быть полезным для CWD наблюдения в диких и плен оленей.

Protocol

1. RT-QuIC используя фекалии , Подготовка cervid Кала извлекает сделать фекальных огневки, добавив 1 g фекального материала до 10 мл Кала экстракт буфера (фосфат натрия 20 мм, pH 7.1, 130 мм NaCl, 0,05% 20 анимации, 1 мм PMSF и 1 x дополняют ингибиторы протеазы, ЭДТА бесплатно) дать окончательны?…

Representative Results

CWD фекальных экстрактов, подготовленный на 10% (w/v) смогли семян RT-QuIC реакции, но чувствительность обнаружения была низкой 27. С помощью определенного буфера для фекалий гомогенизации был критический шаг, чтобы избежать высокой фоновой флуоресценции в RT-QuIC ре…

Discussion

RT-QuIC ранее работал для выявления CWD прионов мочи и фекальных экстракты устно зараженных белохвостый олень и оленя мула 38. Система, показанной в этой рукописи является адаптированы методом RT-QuIC assay. Дополнительные меры были включены в «классических» RT-QuIC assay для улучшения обн…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны д-р Байрон Caughey (низ скалистые горы лаборатории) для профессиональной подготовки и плазмид бактериальной выражение ОТР cervid. SG поддерживается программой Канада исследований кафедры. Мы признаем, финансирование для этого исследования SG от Альберта прионных научно-исследовательский институт генома Канады и Альберта сельского и лесного хозяйства через геномом Альберта и университета Калгари в поддержку этой деятельности. Мы признаем исследовательский грант от Фонда Ганн Маргарет животных исследований.

Materials

Materials
Acrodisc seringe filters PALL 4652
amicon Ultra-15 Centrifugal filter Unit Millipore UCF901024
BD 10 ml seringe VWR CA75846-842
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C0378
Corning bottle-top vacuum filters Sigma-Aldrich 431118
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E4884
gentleMACS M Tube Miltenyi Biotec 130-093-236
Guanidine hydrochloride Sigma-Aldrich G4505
Imidazole Sigma-Aldrich I5513
Isopropanol Sigma-Aldrich I9516
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615
Luria-Bertani (LB) broth ThermoFisher Scientific 12780029
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M9272
N2 supplement (100X) ThermoFisher Scientific 15502048
N-lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) Sigma-Aldrich ML9150
Nanosep centrifugal devices with omega membrane 100K PALL OD100C34
Nunc sealing tapes ThermoFisher Scientific 232702
Parafilm M VWR 52858-000
phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Protease inhibitor tablet Roche 4693159001
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Calbiochem 7910-OP
sodium phosphate Sigma-Aldrich 342483
Sodium phosphate dibasic anhydrous Sigma-Aldrich S9763
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphotungstate hydrate (NaPTA) Sigma-Aldrich 496626
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516
Tris-Hydroxy-Methyl-Amino-Methan (Tris) Sigma-Aldrich T6066
Triton-100 Calbiochem 9410-OP
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949
Name Company Catalog Number Comments
Commercial buffers and solutions
BugBuster Master Mix Nogagen 71456-4
Ni-NTA superflow Qiagen 1018401
Phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 (1X) Life Technoligies P5493
UltraPure Distilled Water Invitrogen 10977015
Name Company Catalog Number Comments
Standards and commercial kits
Express Autoinduction System 1 Novagen 71300-4
Pierce BCA Protein Assay Kit ThermoFisher Scientific 23227
Name Company Catalog Number Comments
Equipment setup
AKTA protein purification systems FPLC GE Healthcare Life Sciences
Beckman Avanti J-25 Centrifuge Beckman Coulter
Beckman rotor JA-25.50 Beckman Coulter
Beckman rotor JA-10 Beckman Coulter
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Name Company Catalog Number Comments
Sofware
MARS Data Analysis BMG Labtech
GraphPad Prism6 GraphPad software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Watts, J. C., Balachandran, A., Westaway, D. The expanding universe of prion diseases. PLoS Pathog. 2 (3), (2006).
  2. Wadsworth, J. D., Collinge, J. Update on human prion disease. Biochim Biophys Acta. 1772 (6), 598-609 (2007).
  3. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  4. Groveman, B. R., et al. Parallel in-register intermolecular beta-sheet architectures for prion-seeded prion protein (PrP) amyloids. J Biol Chem. 289 (35), 24129-24142 (2014).
  5. Vazquez-Fernandez, E., et al. The Structural Architecture of an Infectious Mammalian Prion Using Electron Cryomicroscopy. PLoS Pathog. 12 (9), e1005835 (2016).
  6. Wille, H., et al. Structural studies of the scrapie prion protein by electron crystallography. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (6), 3563-3568 (2002).
  7. Caughey, B. Prion protein conversions: insight into mechanisms, TSE transmission barriers and strains. Br Med Bull. 66, 109-120 (2003).
  8. Soto, C., Estrada, L., Castilla, J. Amyloids, prions and the inherent infectious nature of misfolded protein aggregates. Trends Biochem Sci. 31 (3), 150-155 (2006).
  9. Prusiner, S. B. Prions. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (23), 13363-13383 (1998).
  10. McKinley, M. P., Bolton, D. C., Prusiner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
  11. Benestad, S. L., Mitchell, G., Simmons, M., Ytrehus, B., Vikoren, T. First case of chronic wasting disease in Europe in a Norwegian free-ranging reindeer. Vet Res. 47 (1), 88 (2016).
  12. Williams, E. S., Young, S. Chronic wasting disease of captive mule deer: a spongiform encephalopathy. J Wildl Dis. 16 (1), 89-98 (1980).
  13. Gilch, S., et al. Chronic wasting disease. Top Curr Chem. 305, 51-77 (2011).
  14. Johnson, C. J., Pedersen, J. A., Chappell, R. J., McKenzie, D., Aiken, J. M. Oral transmissibility of prion disease is enhanced by binding to soil particles. PLoS Pathog. 3 (7), e93 (2007).
  15. Pritzkow, S., et al. Grass plants bind, retain, uptake, and transport infectious prions. Cell Rep. 11 (8), 1168-1175 (2015).
  16. Mathiason, C. K., et al. Infectious prions in the saliva and blood of deer with chronic wasting disease. Science. 314 (5796), 133-136 (2006).
  17. Tamguney, G., et al. Asymptomatic deer excrete infectious prions in faeces. Nature. 461 (7263), 529-532 (2009).
  18. Haley, N. J., Seelig, D. M., Zabel, M. D., Telling, G. C., Hoover, E. A. Detection of CWD prions in urine and saliva of deer by transgenic mouse bioassay. PLoS One. 4 (3), e4848 (2009).
  19. Spraker, T. R., et al. Validation of monoclonal antibody F99/97.6.1 for immunohistochemical staining of brain and tonsil in mule deer (Odocoileus hemionus) with chronic wasting disease. J Vet Diagn Invest. 14 (1), 3-7 (2002).
  20. Spraker, T., et al. Comparison of histological lesions and immunohistochemical staining of proteinase-resistant prion protein in a naturally occurring spongiform encephalopathy of free-ranging mule deer (Odocoileus hemionus) with those of chronic wasting disease of captive mule deer. Vet Pathol. 39 (1), 110-119 (2002).
  21. Saborio, G. P., Permanne, B., Soto, C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature. 411 (6839), 810-813 (2001).
  22. Atarashi, R., et al. Simplified ultrasensitive prion detection by recombinant PrP conversion with shaking. Nature Methods. 5 (3), 211-212 (2008).
  23. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  24. Atarashi, R., Sano, K., Satoh, K., Nishida, N. Real-time quaking-induced conversion: a highly sensitive assay for prion detection. Prion. 5 (3), 150-153 (2011).
  25. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2), 175-178 (2011).
  26. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217 (2010).
  27. Cheng, Y. C., et al. Early and Non-Invasive Detection of Chronic Wasting Disease Prions in Elk Feces by Real-Time Quaking Induced Conversion. PLoS One. 11 (11), e0166187 (2016).
  28. Cramm, M., et al. Stability and Reproducibility Underscore Utility of RT-QuIC for Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease. Mol Neurobiol. 53 (3), 1896-1904 (2016).
  29. Orrú, C., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  30. Orrú, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).
  31. Atarashi, R., et al. Ultrasensitive human prion detection in cerebrospinal fluid by real-time quaking-induced conversion. Nat Med. 17 (2175-2178), (2011).
  32. Orrú, C. D., et al. A test for Creutzfeldt-Jakob disease using nasal brushings. N Engl J Med. 371 (19), 519-529 (2014).
  33. Orrú, C. D., et al. Rapid and sensitive RT-QuIC detection of human Creutzfeldt-Jakob disease using cerebrospinal fluid. MBio. 6 (1), (2015).
  34. Sano, K., et al. Early detection of abnormal prion protein in genetic human prion diseases now possible using real-time QUIC assay. PLoS One. 8 (1), e54915 (2013).
  35. Orrú, C., et al. Detection and discrimination of classical and atypical L-type bovine spongiform encephalopathy by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 53 (4), 1115-1120 (2015).
  36. Orrú, C. D., et al. Bank vole prion protein as an apparently universal substrate for RT-QuIC-based detection and discrimination of prion strains. PLoS Pathog. 11 (6), e1004983 (2015).
  37. Masujin, K., et al. Detection of Atypical H-Type Bovine Spongiform Encephalopathy and Discrimination of Bovine Prion Strains by Real-Time Quaking-Induced Conversion. J Clin Microbiol. 54 (3), 676-686 (2016).
  38. John, T. R., Schätzl, H. M., Gilch, S. Early detection of chronic wasting disease prions in urine of pre-symptomatic deer by real-time quaking-induced conversion assay. Prion. 7 (3), 253-258 (2013).
  39. Henderson, D. M., et al. Rapid antemortem detection of CWD prions in deer saliva. PLoS One. 8 (9), e74377 (2013).
  40. Elder, A., et al. In vitro detection of prionemia in TSE-infected cervids and hamsters. PLoS OnE. 8 (11), e80203 (2013).
  41. Haley, N. J., et al. Prion-seeding activity in cerebrospinal fluid of deer with chronic wasting disease. PLoS One. 8 (11), e81488 (2013).
  42. Haley, N., et al. Detection of chronic wasting disease in the lymph nodes of free-ranging cervids by real-time quaking-induced conversion. J Clin Microbiol. 52 (9), 3237-3243 (2014).
  43. Safar, J., et al. Eight prion strains have PrP(Sc) molecules with different conformations. Nat Med. 4 (10), 1157-1165 (1998).
  44. Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
  45. Wille, H., et al. Surface charge of polyoxometalates modulates polymerization of the scrapie prion protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3740-3745 (2009).
  46. Lee, I. S., Long, J. R., Prusiner, S. B., Safar, J. G. Selective Precipitation of Prions by Polyoxometalate Complexes. J Am Chem Soc. 127 (40), 13802-13803 (2005).
  47. Levine, D. J., et al. Mechanism of scrapie prion precipitation with phosphotungstate anions. ACS Chem Biol. 10 (5), 1269-1277 (2015).
  48. Gonzalez-Montalban, N., et al. Highly efficient protein misfolding cyclic amplification. PLoS Pathog. 7 (2), e1001277 (2011).
  49. Moudjou, M., et al. Glycoform-independent prion conversion by highly efficient, cell-based, protein misfolding cyclic amplification. Sci Rep. 6, 29116 (2016).
  50. Moudjou, M., et al. Highly infectious prions generated by a single round of microplate-based protein misfolding cyclic amplification. MBios. 5 (1), (2013).
  51. Orru, C. D., et al. Human variant Creutzfeldt-Jakob disease and sheep scrapie PrP(res) detection using seeded conversion of recombinant prion protein. Protein Eng Des Sel. 22 (8), 515-521 (2009).
  52. McGuire, L. I., et al. Real time quaking-induced conversion analysis of cerebrospinal fluid in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Ann Neurol. 72 (2), 278-285 (2012).
  53. Orru, C. D., et al. Prion disease blood test using immunoprecipitation and improved quaking-induced conversion. MBio. 2 (3), (2011).

Tags

Keywords: CWD PrionsFecal MaterialReal-time Quaking-induced Conversion AssayCervidChronic Wasting DiseaseSensitive DetectionHigh ThroughputSodium Phosphotungstic Acid PrecipitationRT-QuIC AssayThioflavin T
check_url/pt/56373?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Cheng, Y. C., Hannaoui, S., John, T. R., Dudas, S., Czub, S., Gilch, S. Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material. J. Vis. Exp. (127), e56373, doi:10.3791/56373 (2017).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image