Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

Yo Ching Cheng; Samia Hannaoui; Theodore Ralph John; Sandor Dudas; Stefanie Czub; Sabine Gilch

doi:10.3791/56373

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Artigo de método

Em tempo real a tremer induzida por conversão ensaio para detecção de príons CWD em Material Fecal

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DOI:

10.3791/56373

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29 de setembro de 2017

Yo Ching Cheng^*¹ , Samia Hannaoui^*¹ , Theodore Ralph John² , Sandor Dudas³ , Stefanie Czub³ , Sabine Gilch¹

¹Dept. of Ecosystem and Public Health, Calgary Prion Research Units, Faculty of Veterinary Medicine, University of Calgary, ²Dept. of Molecular Biology, University of Wyoming, ³Canadian Food Inspection Agency, Lethbridge Laboratories

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para descrever uma técnica de amplificação de prião simples, rápido e eficiente, o método de conversão de tremor induzido em tempo real (RT-QuIC).

Resumo

A técnica de RT-QuIC é um sensível em vitro príon celular livre amplificação ensaio baseado principalmente no semeado enrolamento e agregação de substrato de proteína (PrP) recombinante do prião usando sementes de príon como um modelo para a conversão. RT-QuIC é uma nova técnica de alta produtividade, que é análoga à reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR). Deteção de crescimento de amiloide fibrila baseia-se o corante Thioflavin T, que fluoresce a mediante interação específica com proteínas ricas ᵦ-folha. Assim, a formação de amiloide pode ser detectada em tempo real. Procurou-se desenvolver um teste de rastreio não-invasiva confiável para detectar os príons de doença (CWD) desperdiçando crônica no extrato fecal. Aqui, nós adaptamos especificamente a técnica de RT-QuIC revelará o PrP^Sc semeadura atividade nas fezes de CWD infectado cervídeos. Inicialmente, a atividade de propagação dos extratos fecais que estamos preparados foi relativamente baixa em RT-QuIC, possivelmente devido a potenciais inibidores de ensaio no material fecal. Para melhorar a atividade de preparação de extratos de fezes e remover potenciais inibidores de ensaio, nós homogeneizado as amostras fecais em um buffer que contém detergentes e inibidores de protease. Também apresentámos as amostras de diferentes metodologias para concentrar o PrP^Sc com base na precipitação de proteínas usando ácido fosfotúngstico de sódio e força centrífuga. Finalmente, os extratos de fezes foram testados por otimizado RT-QuIC que incluiu a substituição de substrato no protocolo para melhorar a sensibilidade da deteção. Assim, estabelecemos um protocolo para a deteção sensível de príons CWD semeadura atividade nas fezes de cervídeos pré-clínicos e clínicos por RT-QuIC, que pode ser uma ferramenta prática para o diagnóstico não-invasivo de CWD.

Introdução

Doenças do prião ou encefalopatias espongiformes transmissíveis (EET) são doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Creutzfeldt - Jakob (CJD) em humanos, a encefalopatia espongiforme bovina (EEB) em bovinos, tremor epizoótico dos ovinos e caprinos e desperdiçando crônica doença (CWD) em cervídeos ¹^,². EET caracterizam-se pela aparência distintiva espongiforme e perda de neurônios do cérebro. De acordo com a hipótese de "proteína apenas", príons são principalmente compostos de PrP^Sc ('Sc' para o tremor epizoótico) ³, uma isoforma misfolded da proteína príon celular cod....