Purificação de DNA Viral para a identificação de proteínas Viral e celulares associadas

Resumo

O objetivo do presente protocolo é especificamente tag e seletivamente isolar o DNA viral de células infectadas para caracterização de proteínas do genoma viral associada.

Resumo

O objetivo do presente protocolo é de isolar o vírus do herpes simplex tipo 1 (HSV-1) de DNA de células infectadas para a identificação de associado viral e proteínas celulares por espectrometria de massa. Apesar de proteínas que interagem com genomas virais desempenham papéis importantes na determinação do resultado da infecção, uma análise abrangente das proteínas do genoma viral associado não foi anteriormente possível. Aqui vamos demonstrar um método que permite a purificação direta do HSV-1 genomas de células infectadas. Replicação de DNA viral seletivamente é rotulado com nucleotídeos modificados que contêm um grupo funcional de alquino. Rotulado de DNA é então especificamente e irreversivelmente com a tag através a ligação covalente de azida de biotina, através de um de cobre (I)-catalisada reação de cicloadição ou clique azida-alquino. Biotina-tag DNA purified em grânulos streptavidin-revestido e proteínas associadas são eluídas e identificadas por espectrometria de massa. Este método permite a seleção de alvos e isolamento de forquilhas de replicação do HSV-1 ou toda genomas de ambientes biológicos complexos. Além disso, a adaptação desta abordagem permitirá para a investigação de vários aspectos da infecção herpética, bem como o exame dos genomas de outros vírus de DNA.

Introdução

Vírus têm uma capacidade limitada para realizar funções essenciais e, portanto, dependem de fatores do hospedeiro para facilitar os aspectos críticos da infecção, incluindo transporte, replicação, reparo, recombinação e expressão gênica viral. As atividades desses fatores do hospedeiro são, muitas vezes acentuadas por proteínas virally codificadas. Além disso, o vírus devem evitar deteção e interferência por respostas celulares à infecção viral. Portanto, interações hospedeiro de vírus ditam o resultado da infecção. De suma importância é entender como vírus alteram o ambiente celular para adaptar-se a maquinaria celular para facilitar processos virais. De particular i....

Protocolo

1. cultura celular, infecção Viral e rotulação de EdC ( Figura 1)

o seguinte protocolo envolve trabalhar com vírus. Por favor, consulte sua instituição ' protocolos de biossegurança s sobre manipulação segura de vírus e outros agentes biológicos. Este protocolo foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional da Universidade de Pittsburgh.

1. Trypsinize um frasco de cultura de tecidos confluente 150 cm ² de MRC-5 células e as células de transferência para uma placa de cultura de tecido de ² 600 cm contendo 100 mL DMEM acrescido de 10% FBS. Incube a 37 ° C, na presença de 5%....

Resultados

O uso da química clique para a purificação do DNA de células primeiro foi realizado pelo iPOND método²¹. O objetivo do iPOND é purificar forquilhas de replicação celular, para a identificação de proteínas associadas. Nós adaptamos essa técnica para estudar especificamente as interações da proteína vDNA durante a infecção. Manipulação da abordagem de rotular genomas virais com EdC (Figura 1), combinadas com infecções sincronizadas, perm.......

Discussão

Este protocolo inclui várias etapas que, se não seguido com atenção, podem resultar em rendimento de proteína significativamente reduzida ou contaminação com o DNA celular. É fundamental que células fixas são utilizadas para todas as experiências para garantir que o DNA celular não é rotulado e purificado. Isto pode ser confirmado pela ausência de polimerases de DNA celulares na amostra de proteína porque HSV-1 não utiliza DNA-polimerase celular para a síntese do genoma. Durante EdC rotulagem e núcleos etapas de colheita.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Células MRC-5	ATCC	CCL-171
Soro Fetal Bovino (FBS)	Gibco	26140-179
Meio de Águia Modificado de Dulbecco (DMEM)	Gibco	12800-082	Substituído por 10% de FBS, 2 mM L-glutamina, 12 mM  (para crescimento em frascos) ou 30 mM (para crescimento em pratos) bicarbinato de sódio
600 cm2 placa	de cultura de tecidos Thermo Fisher Scientific	166508
Tris Buffered Saline (TBS), pH 7,4			137 mM NaCl, 5 mM KCl, 491 mM MgCl, 680 mM CaCl, 25,1 mM Tricine
HSV-1 estoque			Estoques com títulos superiores a 1x109 PFU/mL funcionam melhor
Sephadex G-25  coluna (Coluna de dessalinização PD-10)	GE Healthcare	17085101
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Fisher Scientific	D128-1
5&agudo;-etinil-2&agudo;-desoxicitidina (EdC)	Sigma-Aldrich	T511307	Dissolva em DMSO para preparar estoque de 40 mM, alíquota e armazene a -20 ° C
2&agudo;-desoxicitidina (deoxyC)	Sigma-Aldrich	D3897	Dissolva em água para preparar estoque de 40 mM, alíquota e armazene a -20 ° C
Tampão de extração nuclear (NEB)			Prepare fresco (20 mM Hepes pH 7,2, 50 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 300 mM Sacarose, 0,5% Igepal)
Raspador de células Vidro	Bellco	7731-22000	Autoclave antes do uso
Solução de azul de tripano	Sigma-Aldrich	T8154
PBS, pH 7,2 (10x)			1,37 M NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 18 mM KH2PO4 (diluir a 1x em água estéril antes de usar)
Sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO4-5H2O)	Fisher Scientific	C489	Prepare 100 mM de estoque e armazene a 4 ° C por até 1 mês
(+) L-ascorbato de sódio	Sigma-Aldrich	A4034	Prepare 100 mM de estoque e armazene no gelo até o uso
Biotina azida	Invitrogen	B10184	Prepare 10 mM de estoque em DMSO, alíquota e armazene a -20 ° C por até 1 ano
Clique em Mistura de			Prepare imediatamente antes de usar adicionando reagentes na ordem indicada (10 mL: 8,8 mL 1x PBS, 200 mL 100 mM CuSO4, 25mL 10 mM Biotina Azida, 1 mL 100 mM ascorbato de sódio)
Coquetel Completo de Inibidor de Protease	Roche	11697498001	Dissolver em 1 mL de água para preparar 50x estoque, pode armazenar a 4 &graus; C por até 1 semana, ou adicione diretamente 1 comprimido a 50 mL
de tampão Congelamento			Prepare fresco (7 mL 100% glicerol, 3 mL NEB, 200 μ L 50x inibidor de protease)
Tampão B1			Prepare fresco (25 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1% Igepal, 1x inibidor de protease)
Tampão B2			Prepare fresco (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 0,5% Igepal, 1x inibidor de protease)
Tampão B3			Prepare fresco (150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8, 1x inibidor de protease)
Vibra Cell Ultra Sonic Processer equipado com uma sonda microtip de 3 mm	Sonics	VCX 130
Cell strainer	Falcon	352360
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Life Technologies	65601
DynaMag-2 Magnet	Life Technologies	12321D
Mini-Tube Rotator	Fisher Scientific	260750F
2x Tampão			Misture 400 mg de SDS, 2 mL de 100% de glicerol, 1,25 mL de 1 M Tris (pH 6,8) e 10 mg de azul de bromofenol em 8 mL de água. Armazenar em 4  ° C por até 6 meses. Antes de usar, adicione 1 M DTT a uma concentração final de 200 mM.
Travas de tampa para tubo de 1,5 mL	Reagentes
Kit de coloração azul coloidal	Invitrogen	LC6025
Placa de cultura de tecidos de 12 poços	Corning	3513
Coverslips	Fisher Scientific	12-545-100	Autoclave antes do uso
Lâminas de microscópio	Fisher Scientific	12-552-5
16% paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Sciences	15710	Diluir a 3,7% em 1x PBS antes de usar
Albumina de soro bovino (BSA)	Fisher Scientific	BP1605	Preparar 3% em 1x
PBS Tampão de permeabilização (0,5% Triton-X 100)	Sigma-Aldrich	T8787	Preparar 0,5% Triton-X 100 em 1x PBS
Coquetel de reação de clique - Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Kit de Imagem	Sondas Moleculares	C10337	Preparar de acordo com o protocolo do fabricante
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	Preparar 10 mg/mL em água, pode armazenar a 4 &graus; C por até 1 ano
Anticorpo primário anti-ICP8 de camundongo	Abcam	ab20194	Use uma diluição de 1:200 em 1x
PBS Anticorpo primário de camundongo anti-UL42 (2H4)	Abcam	ab19311	Use uma diluição de 1:200 em 1x
PBS Cabra anti-camundongo 594-conjugado anticorpo secundário	Technologies	a11005	Use uma diluição de 1:500 em 1x PBS
Immu-mount	Thermo Fisher Scientific	9990402
		SDS-bicarb	2% SDS, 200 mM NaHCO3
Fenol:clorofórmio:álcool			Misture 25:24:1 pelo menos 1 dia antes de usar, armazene a 4 ° C no escuro
clorofórmio: álcool			Misture 24:1 pelo menos 1 dia antes de usar, armazene em temperatura ambiente no escuro
10x Tris EDTA (TE), pH 8,0			100 mM Tris, 10 mM EDTA (dilua para 1x antes de usar)
Kit de purificação Qiaquick PCR	Qiagen	28104
3 M acetato de sódio pH 5,2
Qubit 2.0 Fluorômetro	Invitrogen	Q32866
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32851
Tubos de ensaio Qubit	Invitrogen	Q32856
Microscópio de fluorescência equipado com software
Microcentrífuga para tubos
Centrífuga de mesa para tubos de
Célula incubadora de
Gabinete de
Heat blocks			65 ° C e 95 &graus; O

reação de amostra Laemmli de Western blotting padrão NC9679153 Fisher Scientific Life 2x solução isoamílico isoamílico de imagemde 1,5 mL15 e 50 mLculturabiossegurança