Overlappende Peptide bibliotheek Qa-1 Epitopes in een proteïne in kaart
Summary
QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b moleculen. Immunisatie met QA–1-bindende epitopes heeft aangetoond dat weefsel-specifieke immuunregulatie vergroten en verbeteren van verschillende auto-immuunziekten. Hierin beschrijven we een overlappende peptide bibliotheek strategie voor de identificatie van QA–1 epitopes in een eiwit.
Abstract
QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) moleculen. Recente gegevens suggereren dat QA–1 moleculen spelen een belangrijke rol in de landmeetkunde cellen voor structurele en functionele integriteit, inducerende immuunregulatie, en de beperking van immuun reacties op virale infecties. Bovendien, functionele vergroting van Qa-1-beperkte CD8+ T cellen via epitoop immunisatie therapeutische effecten heeft aangetoond in verschillende auto-immuunziekte diermodellen, bijvoorbeeld experimentele allergische encephalomyelitis, collageen-geïnduceerde artritis en nietzwaarlijvige diabetes. Daarom is er dringend behoefte aan een methode die snel en efficiënt functionele QA–1 epitopes in een eiwit identificeren kan. Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van Qa-1-beperkte CD8+ T cel lijnen specifiek voor een overlappende peptide (OLP) bibliotheek voor het bepalen van de QA–1 epitopes in een eiwit. Deze OLP bibliotheek bevat 15-mer overlappende peptiden die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit en aangrenzende peptiden overlappen door 11 aminozuren. Met behulp van dit protocol, we onlangs geïdentificeerd een epitoop QA–1 9-mer in myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG). Deze nieuw toegewezen MOG QA–1 epitoop bleek voor het opwekken van epitoop-specifieke, QA–1-beperkte CD8+ T cellen die verbeterde myeline-specifieke immuunregulatie. Dit protocol is daarom nuttig voor toekomstige onderzoek van nieuwe doelstellingen en functies van Qa-1-beperkte CD8+ T cellen.
Introduction
QA-1 behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) moleculen in muizen. De menselijke homolog is HLA-E. Vorige bewijs heeft aangetoond dat QA–1 moleculen belangrijke biologische functies hebben. Ten eerste, QA–1 moleculen spelen een belangrijke rol in de landmeetkunde cellen voor structurele en functionele integriteit. In dit verband QA–1 moleculen geëvolueerd verschillende strategieën voor het controleren van de normale functie van een cel. Een dergelijke strategie kunt QA–1 moleculen naar formulier complexen met een verwerkte leider peptide (epitope), dat wil zeggen de Qa-1 determinant modifier (Qdm) dat is verwerkt uit klassieke MHC-Ia moleculen in het endoplasmatisch reticulum-1. Deze QA–1/Qdm complexen later weer op het oppervlak van een cel en een binding met remmende NKG2A receptoren op NK-cellen voor de remming van de NK activiteit2doden. Als de expressie van MHC-Ia moleculen verbroken wordt, wordt een cel (bijvoorbeeld een kwaadaardige cel) gevoelig voor NK doden2. De andere strategie mogelijk maakt QA–1 moleculen te vormen nieuwe QA–1/epitoop complexen op het oppervlak van een cel dat tekortschiet in TAP (vervoerder gekoppeld aan antigeen processing)3 en/of ERAAP (endoplasmatisch reticulum aminopeptidase gekoppeld in4 van het antigeen processing) (beide tekortkomingen vaak voorkomen in kwaadaardige cellen). De cel die deze nieuwe QA–1/epitoop complexen uitdrukt kan vervolgens worden herkend en uitgeschakeld door de epitoop-specifieke Qa-1-beperkte CD8+ T cellen. Ten tweede, QA–1 moleculen induceren immuunregulatie5. In dit verband QA–1/epitoop complexen is aangetoond dat het stimuleren van CD8+ regulatoire T (Walter) cellen die belangrijk voor de preventie van immuun-gemedieerde schade van zelf-weefsels6,7,8 zijn ,9,10. Ten derde, Qa-1-beperkte CD8+ Treg cellen is aangetoond dat het beperken van de immuunrespons tegen virale infectie11.
Dus, de vergroting van het specifieke van epitoop-specifieke QA–1-restrictred CD8+ T cellen is een potentieel veelbelovende strategie voor het wegwerken van abnormale cellen, voor de verhoging van de immuunregulatie, en voor de controle van de omvang van virus-geïnduceerde immuunreacties. Terwijl het is niet vastgesteld of vergroting van epitoop-specifieke Qa-1-beperkte CD8+ T cellen kunnen vergroten immuun toezicht en virus-geïnduceerde immuunreacties beperken, onze laboratoria en anderen hebben duidelijk aangetoond dat immunisatie met QA–1 epitopes kan vergroten de functie van Qa-1-beperkte CD8+ Treg specifieke cellen voor pathogene auto-immune CD4+ T cellen, wat leidt tot efficiënte controle van CD4+ T-cel-gemedieerde auto-immune ziekten in een scala aan dierlijke modellen zoals experimentele allergische encefalomyelitis (een dierlijk model van menselijke multiple sclerose)6,10, collageen-geïnduceerde artritis (een dierlijk model van menselijke reumatoïde artritis)7, en nietzwaarlijvige diabetes (een dierlijk model van menselijke type 1 diabetes)8. Daarnaast hebben we ontdekt dat immunisatie met een epitoop weefsel-specifieke QA–1 tot een specifiek besturingselement van immuun-gemedieerde ontsteking in dat weefsel door vergroting van CD8 leidt+ Treg cellen12. De bovenstaande successen van preklinische studies geven een behoefte aan een volledige beoordeling van QA–1 epitoop immunisatie voor de behandeling van weefsel-specifieke immuun-gemedieerde aandoeningen en potentieel voor de therapie van andere ziekten in verband met tekortkomingen in de kraan en ERAAP.
Dienovereenkomstig, is er een vraag voor een technologie die betrouwbaar en snel QA–1 epitopes in een eiwit analyseren kan. In dit verband is een beperkt aantal biologisch belangrijke QA–1 epitopes beschreven. De meeste van deze epitopen QA–1 per werden vastgesteld tijdens de studie van CD8+ T cel reacties op bacteriën13, tekort aan TAP3cellen, tekort aan ERAAP4cellen en cellen die EAE6veroorzaken, 9. Daarom is een hoge doorvoer techniek wenselijk voor de identificatie van biologisch belangrijke QA–1 epitopes in een bepaald eiwit. In het volgende, beschrijven we een overlappende peptide (OLP) bibliotheek strategie die kaarten van functionele QA–1 epitopes in een proteïne met behulp van CD8 QA–1-resrticted+ T cel lijnen specifiek voor de OLP zwembad (OLP_pool) van een eiwit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we een protocol voor het analyseren van QA–1 epitopes in een eiwit beschreven. Met betrekking tot dit protocol, werden verschillende andere strategieën ook eerder gemeld. Eerste, allogene CD8+ T cellijnen en klonen werden gebruikt voor de identificatie van de Qdm1. Ten tweede, een vermeende QA–1-bindende motief uit de analyse van Qdm werd gebruikt voor de identificatie van de HSP60p216-224 en een TCRBV8.1 epitoop9,18</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Penelope Garcia voor haar technische bijstand en de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie voor innovatie (RIG) van het departement of Medicine aan de Loma Linda University (681205-2967) en een pilot subsidie van de National Multiple Sclerosis Society (PP1685) voor de XT.
Materials
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
Referências
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
