Bu iletişim kuralı Zika virüs enfeksiyonu gelişmekte olan insan beyninin model oluşturmak için kullanılan bir teknik anlatılmaktadır. Wildtype veya mühendislik kök hücre hatları kullanarak, araştırmacılar, çeşitli mekanizmalar veya erken beyin enfeksiyon ve Zika virüs bulaşmış embriyo elde edilen microcephaly etkileyebilir tedavi ortaya çıkarmak için bu tekniği kullanabilir.
Zika virüs (ZIKV) duyarlı nüfusu son ortaya çıkması microcephaly ani bir artış ve yeni doğan bebeklerde nörogelişimsel koşulları yol açmıştır. Sivrisinek viral iletim ana yol olmakla birlikte, aynı zamanda cinsel temas ve dikey anne fetus iletim yaymak için gösterilmiştir. Bu ikinci durumda iletim, ZIKV, benzersiz viral tropism nedeniyle virüs gelişmekte olan beyin nöral progenitör hücrelerinin (NPCs) ağırlıklı olarak hedefe inanılıyor.
İnsan beyin organoids maruz burada modelleme ZIKV enfeksiyon ve sonuç microcephaly için bir yöntemi, bu ZIKV yaşamak için açıklanan meydana gelir. Organoids virüs nöral progenitör nüfusları içinde yüksek düzeyde görüntülemek ve şiddetli hücre ölümü ve microcephaly zaman içinde sergilemek. Bu üç boyutlu beyin organoid modeli tür eşlemeli deney gözlemlemek ve potansiyel olarak gelişmekte olan insan beyninin ZIKV enfeksiyon ile müdahale araştırmacılar verir. Model üzerinde standart iki boyutlu yöntemleri geliştirilmiş alaka sağlar ve insan özgü hücresel mimarisi ve hayvan modellerinde mümkün olmayan protein ifade içerir.
Zika virüs (ZIKV) Mikronezya, Fransız Polinezyası ve Amerika’nın hızla yayıldı ve son zamanlarda nörogelişimsel hastalıklara kadar önde gelen gelişmekte olan fetal beyin bulaştırmak için plasenta bariyerini1,2 geçmeye gösterilmiştir microcephaly3,4,5,6 . Bu hasta hayatını ve tedavi, geçerli eksikliği üzerinde uzun vadeli etkisi araştırmacılar ve klinisyenler daha iyi ZIKV enfeksiyon ve çoğaltma arkasında mekanizmaları anlamak için mücâdele yol açmıştır. Önceki çalışmalarda ZIKV enfeksiyon, vitro sistemlerinin fizyolojik ilgili hücre türleri7,8,9, hem de vivo içinde10 ile çeşitli inceledik immün ve immün fareler11,12,13 ve insan dışı primatlar14,15,16. Bu daha geleneksel teknikleri yanı sıra çeşitli gruplar ZIKV enfeksiyon gelişmekte olan insan beyninin daha iyi anlamak için kök hücre kaynaklı serebral organoids hayata geçirdik. Bu gruplar insan beyin organoids microcephaly fenotip17,18onaylamak, virüs giriş19‘ a bağlı reseptörleri araştırmak, enfeksiyon20 fizyolojik yanıtlarını incelemek için kullanılan , 21ve potansiyel olarak uyuşturucu adaylar22için ekran. Burada hızla üreten ve kök hücre elde edilen serebral organoids bulaşmasını tekniği,19ZIKV enfeksiyon gelişmekte olan insan beyninin anlayış geliştirmek için daha önce gösterildiği gibi kullanılmıştır.
Organoids standart pluripotent kök hücre (PSC) kültürleri oluşturulmuş bu teknik bilimsel sorular çeşitli için gelişmekte olan beyin viral enfeksiyon ile ilgili olarak yanıtlanmasını sağlar. Örneğin, CRISPR mühendislik bu PSC hatları19pt vivo genetik çalışmalar daha hızlı bir hızda organoid enfeksiyonu önce değiştirmek için kullanılabilir. Ayrıca, standart iki boyutlu (2D) farklılaşma kültürlerde farklı olarak corticogenesis için önemlidir karmaşık hücresel mimarisi organoids sergi ve bu mimari enfeksiyon kesilebilir son çalışmalar göstermiştir 21. Son olarak, nispeten düşük maliyetli organoids üreten yüksek üretilen iş deneme ve in vivo modellere kıyasla tarama için izin verir. Öte yandan, ZIKV çalışmaya organoids kullanımı bazı sakıncaları vardır. Organoids 2D kültürleri çok daha biyolojik ilgili olmakla birlikte, orada ek zorluklar nedeniyle üç boyutlu (3D) doğaları organoids değerlendirilmesi. Görüntüleme ve organoids ayrılma eğilimi daha fazla ekipman ve standart 2D kültürlerde daha kaynak daha büyük bir yatırım dahil etmek. Ayrıca, organoids damarlara ve araştırmacılar bu yönlerini viral enfeksiyon baktılar bir alternatif iletişim kuralı aramak için tavsiye edilir böylece in vivo modellerinde mevcut immünolojik bileşenleri yoksundur.
Orada bir takım teknikler insan organoids ve kültür neurospheres oluşumu için ve genellikle içinde desenli veya unpatterned kategorilere ayrılır. Wnt, BMP, TGFβ ve diğer sinyal yolu farklılaşma belirli soy23doğru itmeye düzenleyen faktörler desenli yöntemleri uygulayın. Burada açıklanan gibi unpatterned yöntemleri İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSCs) için eğilimi yararlanmak ve insan embriyonik kök nöroektodermal lineage tarafından doğru ayırt etmek için hücreleri (hESCs)24varsayılan. Farklılaşma yaklaşık üç hafta sonra elde edilen organoids erken gelişen beyin gözlenir birkaç hücre tipleri içeren büyük, biomimetic neuroepithelial yapılar oluşur.
Organoids standart, besleyici-Alerjik PSC kültürlerden üreten ve bu organoids ZIKV ile hastalık için teknik tam olarak sunulur. Besleyici-Alerjik PSC’ler için gereken kodlamayla yöntemleri konusunda kılavuz bilgiler için lütfen önceki yöntemleri yayınları25,–26bakın. Ayrıca, virüs birden çok deneyler için tutarlı miktarda uygulamak için MOI önceden hesaplamak önemlidir. Bu bir enfeksiyon tedavi kaplaması orta, kuluçka ve immunostaining ardından Vero hücrelerinin yaparak yapılır. Açıklamaları ve yöntemleri bu tekniğin daha önce açıklanan19,27olmuştur.
Hedef izdiham % 50-%70, PSC kültür ulaştıktan sonra hücreler sonra ayrışmış ve ultra düşük ek 96-şey kalıplara toplanan. Hücreleri kök hücre xeno ücretsiz bakım medya (SCMM) 3 gündür sürdürülen ve bir sinir indüksiyon medya kültürü geri kalanı için dönüştürülür. Organoids 3 hafta boyunca ayrıştırılan bir kez enfeksiyon yapılabilir. Görüntüleri enfeksiyonu takip hafta boyunca düzenli olarak tercih ederek, araştırmacılar ilerici hücre ölümü ve organoid bozulma gözlemlemek olacaktır. Araştırmacılar da bu transkripsiyon yapmak için zaman ya da proteomik profil oluşturma organoids ayırmak. Cryosectioning ve lightsheet yöntemlerini görüntüleme için tavsiye edilir ve araştırmacılar yüksek düzeyde enfeksiyon ve özellikle organoids nöral progenitör hücre (NPC) nüfus içinde viral çoğaltma görmeyi bekleyebilirsiniz. Sonuçta, bu teknik araştırmacılar hızla düşük maliyetli ve sınırlı donanımları ile insan beyninin viral enfeksiyon mekanizmaları incelemek için izin verir.
İnsan beyin organoids kullanan ZIKV enfeksiyon araştırmak için dikkate çeşitli uyarılar vardır. Bir önemli göz o organoid oluşumu ve yapısı içinden oluşturdular kök hücre satırdaki son derece bağlıdır. İsogenic mühendislik satırları da dahil olmak üzere hücre aralarını karşılaştırırken dikkat çekmek; birden çok subclones ve ideal olarak birden çok kök hücre hatları kullanarak sonuçlar yapmak en iyisidir. Ayrıca hücre hatlarında bu farklılıktan dolayı pilot deneyler uygun farklılaşma organoids içinde oluştuğunu emin olmak için tavsiye edilir. Neuroepithelial yapıları aydınlık alan mikroskobu tarafından görünür olsa da, aynı zamanda sinir ayırt etme belirteçleri PAX6 veya fosfo-vimentin gibi aramak için qRT-PCR veya cryosectioning deney için önerilmektedir.
Bir de organoids içinde aynı hücre kültürünü arasında önemli ölçüde değişkenlik öngörmelisiniz. Protokol unpatterned yapısı nedeniyle, neuroepithelial yapıları boyutunu ve sayısını bireysel organoids arasında değişebilir. Genellikle, bir en az iki büyük bekleyebilirsiniz (> D24 tarafından çapı 200 µm) organoid başına sinir rozet. Bu nedenle, enfeksiyon, üzerine organoid boyutunda değişiklik gözlenmesi gibi uzunlamasına çalışmalar özellikle aydınlatıcı olan. Toplu işlemleri arasında değişkenlik de, bunun en olası nedeni ile hatalı hücre sayımı veya tohum olmak ortaya çıkabilir. Bu birden çok kez yapmak ve hücre süspansiyon iyi ULA U-alt 96-şey plakalar tohum önce karışık emin olmak için tavsiye edilir.
Organoids ULA U-alt 96-şey tabak içinde kültür zaman plakaların kenarlarda önemli buharlaşma etkileri görmek planı. Bu kuyu PBS ile doldurun ve sadece merkezi 60 wells ile çalışmak idealdir. Buharlaşma nedeniyle dış Wells organoids daha fazla büyük olasılıkla onların büyüme ve farklılaşma etkiler merkezi olan farklı koşullara maruz kalacağı. Lütfen bu deneyler için gerekli organoids sayısı planlarken dikkate alın. Ayrıca, organoids kabaca 30 kültür orta renk değişikliği nedeniyle görünür olacak gün sonra 96-şey biçimi sarmak başlayacak. Son 30 gün organoids alarak planlama, organoids ULA 24-şey plakasına aktarmak için önerilir. Transfer yapmak için açılış organoids kendilerini çok daha büyük olması P1000 bahşiş kesmek için makas kullanın ve pipetting tarafından organoids transfer.
İnsan beyin organoids alanın açıkların ve hastalık anlayışı ilerleyen büyük potansiyele sahip. Araştırmacılar iletişim kuralı gerekli olarak değiştirmek için teşvik edilir. Örneğin, bir farklılaşma etkinliğini belirli hücre tipleri, onları viral etkileri bazı anatomik bölgeler üzerinde keşfetmek için izin doğru artırmak için desenlendirme faktörler uygulamak olabilir. ZIKV nörogelişimsel etkileri hala kötü anlaşılır ama bu yeni yaklaşım araştırmacılar enfeksiyon mekanizmaları araştıran bir erişilebilir, hızlı ve yüksek işlem hacmi yol verecektir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Priscilla L. Yang ve Dominique J. Burri, Harvard Tıp Okulu ilk yayılması ve ZIKV miktar ile yardım için teşekkür ederiz. Biz de Nathaniel D. Kirkpatrick görüntüleme destek için teşekkür etmek istiyorum. K.E. psikiyatrik araştırma ve Harvard kök hücre Enstitüsü Stanley Merkezi tarafından desteklenmiştir.
Xeno-Free Stem Cell Maintenance Media (SCMM), TeSR-E8 | StemCell Technologies | 5940 | Use for stem cell maintenance and early stages of organoid formaiton. Store at 4 ᵒC for up to two weeks after prepared from individual components |
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
Enzymatic Detachment Reagent, Accutase | Gibco | A11105-01 | Store aliquoted at -20 ᵒC, do not keep thawed for longer than necessary |
Y-27632 | Selleck Chem | S1049 | Reconstitute to 50mM in DMSO, and keep at -20 ᵒC in 50µL aliquots. |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
Heparin | Sigma-Adrich | H4784-1G | Reconstitute to 2 mg/mL in sterile DI water and store at -20 ᵒC in 250µL aliquots |
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |