Detta manuskript beskriver användningen av nasal och bronkiell absorption tekniker, specifikt använder syntetiska absorptive matriser (SAM) för att prova slemhinna slemhinnan vätskan (MLF) av övre och nedre luftvägarna. Dessa metoder ger bättre standardisering och tolerabilitet än befintlig respiratoriska urvalsmetoder.
Metoder för nasal absorption (NA) och bronkial absorption (BA) använda syntetiska absorptive matriser (SAM) för att absorbera den slemhinna slemhinnan vätskan (MLF) av människans luftvägar. NA är en icke-invasiv teknik som absorberar vätska från sämre Concha, och orsakar minsta möjliga obehag. NA har gett reproducerbara resultat med möjlighet att ofta upprepa provtagning av de övre luftvägarna.
I jämförelse, alternativa metoder för provtagning respiratoriska slemhinnan, såsom nasofaryngealt aspiration (NPA) och konventionella badda, är mer invasiv och kan resultera i större data variabilitet. Andra metoder har begränsningar, till exempel biopsier och bronkial förfaranden är invasiva, sputum innehåller många döda och döende celler och kräver kondensering, utandningsluften kondens (EBC) innehåller vatten och saliv och lavage prover är utspädd och variabel.
BA kan utföras genom arbetar kanalen av en bronkoskopet i klinik. Provtagning är väl tolererad och kan bedrivas på flera platser i luftvägarna. BA resulterar i MLF prover vara mindre utspädd än bronkoalveolär lavage (BAL) prover.
Denna artikel visar tekniker för NA och BA, samt laboratorium bearbetning av de resulterande tar prov, som kan anpassas till den önskade nedströms biomarkör som mäts. Dessa absorption tekniker är användbara alternativ till de konventionella provtagning tekniker som används i kliniska respiratorisk forskning.
De flesta respiratoriska sjukdomar orsakar en inflammatorisk reaktion, och det finns ett akut behov för provtagning från luftvägarna slemhinneepitel i allergisk rinit, virus-och svampinfektioner, tuberkulos, astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, pulmonell fibros och lung cancer 1. Nasofaryngealt aspirera (NPA), nasal lavage och bronkoalveolär lavage (BAL) är vanliga tekniker för provtagning övre och nedre luftvägarna. Dock närvarande dessa tekniker avsevärda problem inklusive dålig tolerabilitet, utspädning av inflammatoriska mediatorer och oförmågan att ofta upprepa provtagning2. Ett alternativ till NPA provtagning är användningen av kompresser, antingen nylon flockade, bomull eller rayon3,4, men dessa har också begränsningar, eftersom de orsakar obehag och skador på nasal epitel, och i vissa fall irreversibla bindning av inflammatoriska mediatorer5. Dessa tekniker kan inte generellt upprepas seriellt över en timme, och alternativa tekniker kan vara effektivare för upptäckt av låga överflöd cytokiner och chemokiner5,6. Dessutom kan användaren variabiliteten är associerad med dessa tekniker genererar inkonsekvenser i data, vilket resulterar i kravet på större patientgrupper.
Alternativt har absorption-tekniker som utnyttjar både naturliga och syntetiska svampar använts för att samla MLF från slemhinnorna. Oftalmologiska svampar består av naturlig cellulosa (t.ex., Weck-cel) har använts till exempel saliv, livmoderhalscancer, och slidsekret7. Dessutom syntetiska svampar tillverkad av polyvinylalkohol (PVA) och hydroxylerade polyvinylacetat (HPVA) har varit utnyttjad8. Sju olika absorberande material har jämförts för provtagning oral vätska före mätning antikroppar9, medan polyuretan mini-svampar har använts för att samla mänskliga tårar10.
Filter papper bestående av naturlig cellulosa från bomullsväxten har använts i stor utsträckning att absorbera nasala secretions sedan banbrytande papperet Alam och kollegor 199211,12,13,14, 15,16,17. Filtrerpapper skivor har framställts från filtret kort (t.ex. Shandon) och har använts för att mäta histaminer och cytokiner efter kontrollerade nasal allergen utmaningar och med naturliga allergen exponering18,19 ,20,21. Olika partier av filterpapper varierar dock i deras grad av proteinbindning och vissa misslyckas att släppa cytokiner. Metoder med en syntetisk absorptive matris (SAM) har därför varit utvecklade2,22,23. SAMs är nu allmänt används att erhålla nasal MLF av NA. Dessa absorberande material är bekväma att använda och kan få MLF även från inflammerade näsor med täta intervall över längre tidsperioder.
Nasal absorption är en form av Precision slemhinnor provtagning med hjälp av en SAM för provtagning av MLF i de övre luftvägarna. NA enheter tillverkas som CE-märkta medicintekniska produkter från medicinsk kvalitet material med rena rum och är fria från damm och allergener. NA Provtagaren består av ett handtag och SAM i en steril cryotube. SAM består av polymerer, typiskt fibrer, men det finns också som skum, och dessa är valda för att vara mjuk och absorberande, med snabba fuktspridande för provinsamling. SAMs har minimal proteinbindning att tillåta den effektiva elueringen av absorberad sekret. NA är en mycket mild, icke-invasiv teknik som kan utföras på givare i alla åldrar. Dessutom är seriell provtagning, även varje några minuter, möjligt. NA har validerats mot befintliga övre luftvägarna provtagning tekniker5 och upprepad provtagning har gjort generation av kinetiska data efter utmaning av luftvägarna med allergen23,24,25, bakteriell endotoxin26 och viral-typen TLR agonister (RIF, A. et al., manuskript i förberedelse). NA har också använts i spädbarn att undersöka den naturliga historien om atopi27,28,29 och viral bronkiolit30.
Bronkoskopiska microsampling (BMS) är ett förfarande för uppbörd av MLF i de nedersta luftvägarna som har utvecklats av Olympus31,32,33. Tyvärr är detta BMS system endast licensierade i Japan. Olympus levererar två BMS system: en med en fibrös hydroxylerade polyester (FHPE) sond34,35,36,37, och en med en bomull sond33,38, 39 , 40 , 41 , 42 , 43. en stor stötesten har varit att BMS sonden används hos patienter med astma orsakas slemhinnor blödning, med hälften av alla prover som förorenats med blod. Författarna drog slutsatsen att det inte var möjligt att provet MLF med detta BMS system från perifera luftvägarna astma patienter43.
Som ett alternativ, har vi utvecklat BA använder en mjuk SAM som kan utföras under Bronkoskopiska utredningen av de nedersta luftvägarna, inklusive efter experimentell infektion av astmatiska patienter med rhinovirus6. BA enheten består av: en extern ihåliga kateter, en hand-pjäs som på aktiveringen strängpressar SAM och en central plast ledare som har SAM på högkant. När det gäller NA, BA kit är tillverkade av medicinsk kvalitet material med rena rum och är fria från damm och allergener. Enheter är dessutom CE-märkt och tillhandahålls gamma-bestrålade. SAM remsan är mjuk, absorberande och har snabb fuktspridande för provinsamling. Det har också minimal proteinbindning att tillåta den effektiva elueringen av absorberad sekret. Enheten kan passa genom kanalen arbeta av en bronkoskopet och kan användas för att snabbt och prova exakt MLF på specifika platser av intresse i luftvägarna. Till skillnad från BAL eller BMS leder inte BA i kontakt blödning eller ytterligare patientens obehag efter ingreppet.
Noggrann hänsyn bör tas till behandling av NA och BA prover. Prover kan vara direkt fryst och bearbetas i omgångar eller kan behandlas omedelbart. Vilken typ av behandling kan skräddarsys mot vissa nedströms tillämpningar, inklusive immunanalyser för cytokiner, chemokiner och immunglobuliner eller elutions av virala, bakteriella, och värdcell associerade RNA. Vi presenterar kliniska insamling och laboratorium bearbetningsmetoder som är associerad med NA och BA som en guide för kliniska forskare.
Resultat från befintliga luftvägarna urvalsmetoder betraktas som mycket varierande; alternativa urvalsmetoder behövs för att standardisera forskning inom detta fält5. NA BA tillåter provtagning av MLF på ett icke-invasivt sätt och har spännande potential att mäta immunsvar hos friska och sjuka luftvägarna. Dessa tekniker erbjuder många potentiella fördelar jämfört med befintliga tekniker, inklusive större tolerabilitet, hastigheten på provtagning, förmåga att ofta upprepa provtagning, lägre mellan användaren variabilitet, och minskade utspädning av immun medlare5 . Varaktigheten av absorption och den bearbetningsteknik som används bör vara optimerad för varje studie och upprätthålls noggrant mellan provtagning händelser. Dessutom, när det gäller BA, bör platsen för provtagning inom luftvägarna noggrant replikeras mellan individer.
NA och särskilt BA, är fortfarande relativt ny tekniker för klinisk forskning. Fördelarna med dessa tekniker har dock resulterat i deras användning i många studier, inklusive noggrann validering mot alternativa tekniker5. Dessa enheter är nu tillgängliga som CE-märkta enheter redo för utbredd användning i respiratorisk forskning. Även NA och BA resultera i mycket mindre provvolymer än alternativa urvalsmetoder, kan högre erhållna koncentrationer leda till större känslighet för låga överflöd immun medlare.
Beroende på önskad nedströms tillämpningar, kan NA och BA prover direkt frysas för senare bearbetning, förbättra studie genomförbarhet i en miljö med klinisk forskning. Protokollet för provhantering kan också anpassas efter särskilda nedströms applikationer. De föreslagna behandlingen teknikerna kan användas för insamling av protein eller lipid immun medlare eller nucleic syror, men bör optimeras för varje studie. MLF kan i synnerhet vara elueras med olika buffertar. För det första kan immunoassay buffert användas för att mäta slemhinnor cytokiner, chemokiner och antikroppar6,45. Buffertar med högre tvättmedel kan också användas för att garantera cellys inträffar, att tillåta införandet av inom cellulär cytokiner. Chaotropic RNA-extraktion buffertar bör användas för bestämning av virusinfektion, viral load, värd mRNA, och mikrobiomet. Organiska lösningsmedel kan alternativt användas för gammaldags och masspektrometri.
Sammanfattningsvis, är direkt upptagning av MLF från slemhinnorna en spännande teknik med potentiella användning i luftvägarna, gastrointestinal, urogenital och andra slemhinnor sjukdomar. Dock kommer dessa lovande absorption tekniker kräver exakt validering av provtagning och bearbetning teknik för enskilda analyser (biomarkörer) i varje sjukdom inställning. Dessutom kräver dessa roman precision slemhinnor urvalsmetoder validering mot konventionella prover, såsom från blod, andetag och sputum. Med dessa tekniker, kan MLF användas för att mäta mikrober, cytokiner, chemokiner, prostanoider och antikroppar.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering: Detta arbete stöddes av finansiering från Imperial nationella institutet för hälsa forskning (NIHR) Biomedical Research Centre (BRC), den NIHR hälsa skydd Research Unit (HPRU) i luftvägsinfektioner vid Imperial College London i partnerskap med Public Health England (PHE) och NIHR Imperial patientsäkerhet translationell forskningscentrum. De åsikter som framförs är författarnas och inte nödvändigtvis de av NHS, NIHR, Institutionen för hälsa eller folkhälsan England.
Nasosorption (adult, 7mm width) | Hunt Developments | NSFL-FXI-11 | Different sizes are available for different patient groups/ages. |
Bronchosorption | Hunt Developments | BSFL-FXI-11 | Minimum bronchoscope channel size 2mm; Max working length 815mm |
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (without membrane) | Sigma Aldrich | CLS9301-1000EA | |
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters (0.22um membrane) | Sigma Aldrich | CLS8160-24EA | For sterilisation of samples with infection risk. |
Assay (elution) buffer | Millipore | AB-33k | Not listed on the Millipore website but available through enquiry or general lab supply companies, such as Cedarlane. Contains 0.05% Tween-20 and 1% BSA. |
NP-40 Cell lysis buffer | Life Technologies | FNN0021 | Add bovine serum albumin to 1% (w/v). Can recover higher absolute mediator levels. |
Buffer RLT (RNA extraction) | Qiagen | 79216 | Allows recovery of RNA from nasosorption and bronchosorption samples. |
Trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich | 302031-100ML-M | For elution of samples to be used in HPLC applications |
2.0ml micro-centrifuge tubes | Costar | 3213 | 2ml tubes are required for the Spin-X tube filters, traditional 1.5ml tubes will not fit these. |