Uma população altamente pura de megacariócitos pode ser Obtida de cordão hemoderivados CD34+ células. Um método para CD34+ diferenciação de isolamento e megacariócito célula está descrita aqui.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Megacariócito diferenciação e formação de plaquetas de humanos cabo hemoderivados CD34 células+
Neste artigo
Resumo
Resumo
A produção de plaquetas ocorre principalmente na medula óssea em um processo conhecido como thrombopoiesis. Durante thrombopoiesis, células progenitoras hematopoiéticas diferenciam de precursores de plaquetas de formulário chamados megacariócitos, que diferenciam terminal para liberar as plaquetas de processos citoplasmáticos tempo denominados proplatelets. Megacariócitos são células raras confinadas à medula óssea e, portanto, são difíceis de colheita em número suficiente para uso em laboratório. Produção eficiente de megacariócitos humanas pode ser alcançada em vitro por cultivo CD34+ células sob condições apropriadas. O protocolo detalhado aqui descreve o isolamento de CD34+ células por célula magnética, classificação de amostras de sangue de cordão umbilical. São descritos os passos necessários para produzir megacariócitos altamente puros, maduros, em condições de livre de soro. Detalhes de análise fenotípica de diferenciação megacariócito e determinação da produção proplatelet de formação e plaquetas também são fornecidos. Efetores que influenciam a diferenciação do megacariócito e/ou formação proplatelet, tais como anticorpos anti-plaquetários ou mimetics trombopoietina, podem ser adicionados às células cultivadas para examinar a função biológica.
Introdução
Isolamento de números adequados de megacariócitos humanos primários (MK) para uso em laboratório regular não é viável devido a sua baixa frequência na medula óssea, onde eles representam ~0.01% de células nucleadas1. Uma alternativa conveniente é a expansão ex vivo e diferenciação de tronco hematopoiético e células progenitoras na presença de fatores de crescimento específicos. Um número de citocinas, incluindo o fator de células-tronco (SCF; c-kit ligand) e interleucina (IL) -3 e IL-11 foram empregadas nos sistemas de cultura para produzir MKs. Thrombopoietin (TPO) é o fator mais eficaz de crescimento e diferenciação para culturas meg....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Este protocolo foi aprovado pelo sul oriental Sydney humano pesquisa Comitê de ética e ratificado pela Comissão de ética de pesquisa humana a Universidade de New South Wales'. Sangue de cordão umbilical obtido de doadores saudáveis foi fornecido por o Sydney banco de sangue (Sydney, NSW, Austrália). Volumes de cerca de 100 mL foram utilizados para este procedimento.
Nota: Trabalho em uma segurança biológica classe II gabinete utilizando técnica asséptica. Descontaminar o exterior do saco de sangue de cordão com etanol a 70%. Use instrumentos esterilizados (tesouras, pinças) para este procedimento.
1. cabo de isolam....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Este protocolo permite a preparação das culturas de MK altamente puras do cordão hemoderivados CD34+ células. A porcentagem de CD34+ células na medula sangue é, aproximadamente, 1,3%15 (figura 1A) e o número total de células mononucleares (passo 1.8) intervalos de 90-300 x 106 por unidade da UCB. A pureza do CD34 + / CD45 + células após intervalos de isolamento de 90 a 99% (figura 1.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
O protocolo descrito aqui é adequado para uma produção consistente de MK e plaquetas na cultura do sangue do cordão umbilical. Estas células podem ser usadas para estudar vários processos tais como o efeito de drogas ou atividades biológicas na MK proliferação, diferenciação, proplatelet de formação e produção de plaquetas.
Uma variedade de meios de cultura e combinações de citocinas foram apresentados na literatura. Adição de citocinas, como fator de células-tronco, ligante de Flt-3, IL-3 e I.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores reconhecem o apoio da saúde australiano e Medical Research Council (projeto concessão 1012409 ligado ao BHC).
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagentes de Cultura de Células | |||
| Recombinante Humano TPO | Miltenyi Biotec | 130-094-013 | |
| StemSpan SFEM II | Stem Cell Technologies | 9605 | Meio sem soro para células CD34+ |
| Nome | Empresa | Número de Catálogo | Comentários |
| Reagentes de Isolamento CD34 | |||
| CD34 Kit MicroBead ultrapuro | Miltenyi Biotec | 130-100-453 | Este kit inclui o reagente bloqueador de IgG humano FcR e microesferas CD34. Essas esferas contêm o clone de anticorpo anti-CD34 QBEND / 10. Use um clone anti-CD34 diferente para verificação de pureza (por exemplo, clone 8G12). |
| Lymphoprep | Alere Technologies | 1114545 | Meios de separação de linfócitos (densidade 1,077 g/mL) |
| Tampão de separação estéril (SB) | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | Este tampão contém solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2 contendo 0,5% de albumina de soro bovino e 2 mM de EDTA. Pode ser preparado usando componentes estéreis de grau de cultura de células. Desgaseifique antes de usar porque as bolhas de ar podem bloquear a coluna. |
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Citometria de fluxo e reagentes de coloração celular | |||
| PE Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 340669 | Clone 8G12. Isso pode ser usado para verificação de pureza CD34. Concentração final de anticorpos diluição de 1:10. |
| PerCP camundongo anti-humano CD45 | BD Biosciences | 347464 | diluição 1:10 |
| PerCP controle isotipo | BD Biosciences | 349044 | diluição 1:10 |
| FITC Camundongo anti-humano CD41a | BD Biosciences | 340929 | Concentração final de anticorpos diluição 1:5. |
| APC Mouse anti-humano CD42b | BD Biosciences | 551061 | Este anticorpo também pode ser usado para detectar MK maduro (a porcentagem de células positivas geralmente é menor do que com anti CD42a). Concentração final de anticorpos diluição de 1:10. |
| Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human CD42a | AbD Serotec | MCA1227A647T | Atualmente distribuído pela Bio-Rad. Concentração final de anticorpos diluição de 1:10. |
| Alexa Fluor 647 Mouse Controle Negativo | AbD Serotec | MCA928A647 | Atualmente distribuído pela Bio-Rad. Anticorpo de controle de isotipo |
| Anti fator von Willebrand coelho policlonal | Abcam | AB6994 | diluição 1:200 |
| V450 camundongo anti-humna CD41a | BD Biosciences | 58425 | 1:20 diluição |
| V450 controle isotipo | BD Biosciences | 580373 | diluição 1:20 |
| PAC1-FITC anticorpo | Biosciences | 340507 | 1:10 diluição |
| Anti CD62p camundongo monoclonal | Abcam | AB6632 | diluição 1:200 |
| Alexa Fluor 488 cabra anti coelho IgG | Invitrogen | A11008 | diluição 1:100 |
| Alexa Fluor 594 cabra anti camundongo IgG | Invitrogen | A11020 | diluição 1:100 |
| Ig Isotype Control cocktail-C | BD Biosciences | 558659 | Anticorpo de controle de isotipo |
| Iodeto de propídio | Sigma Aldrich | P4864 | |
| CountBright Absolute Counting Beads | Sondas Moleculares, Invitrogen | C36950 | Contas de contagem |
| Nome< | strong>Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Materiais | |||
| Colunas LS | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Colunas menores e maiores também estão disponíveis comercialmente |
| Ímã separador MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Falcon 5mL tubos FACS de polipropileno de fundo redondo, com tampa de pressão, tecnologias estéreis | in vitro | 352063 | |
| lâminas | de vidroMídia de montagem Menzel-Glaser | J3800AMNZ | |
| com DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Mídia de montagem antifade com DAPI |
| strong>Nome | Company | Número de catálogo | Comentários |
| Equipamento | |||
| Microscópio invertido | Leica | DMIRB microscópio | |
| Microscópio fluorescente | Zeiss | Vert.A1 | |
| Analisador celular | BD Biosciences | FACS Canto II | |
| Centrífuga | Cytospin ThermoScientific | Cytospin 4 | |
| Nome | Empresa | Catálogo Número | Comentários |
| Software | |||
| células | BD Biosciences | FACS Diva Software | |
| Software de análise de células únicas | Tree Star | FlowJo | |
| Software para microscópio fluorescente | Zeiss | Zen 2 blue edition |
Referências
- Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
- Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-m....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
