외 인 항 원 비 유전 표면 장식 Avidin 비타민 b 복합체 시스템을 통해 진 균 bovis BCG 백신에의 표현
Summary
세균성 표면에 급속 한 항 원 디스플레이 대 한 새로운 기술, 표면 biotinylation 단위체 avidin와 퓨전에 관심사의 단백질에 노출에 의해 다음을 포함 하 제공 됩니다. 선택 된 항으로 BCG를 성공적으로 로드 표면 장식 전통적인 유전 접근을 대체할 수 있는 제안 그것의 immunogenicity를 향상 시킵니다.
Abstract
결핵 (TB)는 심각한 전염 성 병과 사용 가능한 백신 M. bovis 균 메 게 랭 (BCG)는 안전 하 고 효과적인 어린이 심한 결핵 수 막 염과 결핵 전파의 일부 형태에 대 한 보호 하지만 보호 하기 위해 실패 폐 결핵에 대 한 질병의 가장 일반적인 형태입니다. 현재 BCG를 개선 하기 위해 유망 전략 immunodominant M. 결핵 (Mtb)를암호화 하는 유전자와 그것의 전이 의존-특정 항 원 또는 항 원 자극 하는 것이 공동 요소를 인코딩 하는 유전자와 보완성 셀을 제시. 이러한 접근을 주요 한계는 낮은 효율, 낮은 안정성, 그리고 불확 실한 식 벡터의 안전 수준을 포함합니다. 이 연구에서 우리는 백신 개선, BCG 보완성의 해당 유전자를 인코딩 하는 플라스 미드와 변환 보다는 박테리아의 표면에 대 한 관심의 외 인 단백질로 구성 된 다른 접근 방법 제시. 첫째, 관심사의 단백질은 표현 융합 표준 대장균 에서 단위체 avidin 식 시스템 biotinylated BCG의 표면을 장식 하는 데 사용 하는 고. 동물 실험 꾸며져 대리 ovalbumin 항 BCG 표면을 사용 하 여 수정 된 박테리아는 완벽 하 게 면역성 및 특정 T 세포 응답을 유도 할 수 보여줍니다. 모두, 여기에 강력 하 게 제시 하는 데이터 외 인 핵 산 보완성의 힘 드는 전통적인 접근 방식을 대체 현재 BCG 백신을 재편에 대 한 소설과 효율적인 방법을 지원 합니다.
Introduction
대체 현재 결핵 백신 BCG, 유전자 소개 하도 단백질 보조 시스템, 바이러스 벡터화 기술, 감쇠 라이브 M.tb 긴장, 및 유전자 변형된 BCG 긴장을 포함 한 다양 한 전략 제안 -감염1 또는 Mtb동안 충분히 표현 되지 않는다 BCG 항 원 표현-특정 항 BCG2에 존재 하지. 그러나 유전 공학,, 안전, 시간이 많이 걸리는 프로세스 및 식 벡터4,5의 낮은 효율의 불확 실한 수준을 포함 하는 많은 방 벽을 직면 한다. BCG를 개선에 관해서는 대체 접근 불확 실한 유전 교대에 대 한 필요 없이 immunogenicity를 개선 하기 위해 필요 합니다.
이 연구에서 biotin과 잘 알려진 높은 선호도 avidin 상호 작용을 기반으로 하는 BCG 세포 표면에 대 한 관심의 재조합 단백질의 디스플레이 대 한 새로운 전략을 소개 합니다. 이 접근 방식은 biotinylated BCG, 그것의 우수한 안전 하면서 효능의 최대한 향상을 달성 하기 위해 BCG의 광범위 한 조작을 용이 하 게 표면에 재조합 avidin 융해 단백질의 신속 하 고 재현할 수 첨부 파일 수 기록, 사용의 수 십년 동안 관찰 합니다.
Avidin 비타민 b 복합체에 대 한 선호도 매우 높은 (Kd = 10−15 M) 고 형성, 면 avidin 비타민 b 복합체 복합물은 매우 안정 조건6을 변성 시키기에서 중단 될 수 있습니다. 그러나, 유전자 전송 방법 대안 역할을 상호 작용의이 유형에 대 한 재조합 단백질의 장기 하지만 되돌릴 수 표시가 됩니다. 따라서, 우리는 여기 낮은 선호도 단위체 avidin 도입 (Kd = 10−7 M) 표면에서 단백질의 가역 릴리스 리드 BCG 항 원 제시 세포 안에 섭취 한 번 장식. 개념의 증거를 제공 하기 위해 ovalbumin (OVA)7,8에서 파생 된 대리 항 원에 해당 하는 단위체 avidin 공상 단백질을 사용 하 여이 방법을 테스트 했습니다. 결과 BCG 세포 표면 장식 하실 수 있습니다 쉽고 빠르게 단위체 avidin 융합 단백질 및이 바인딩 BCG 표면에는 안정 되 고 세균성 성장 및 생존에 감지 변경 없이 재현할 수 나타났다. 또한, 우리가 발견 BCG OVA (AviOVA)와 융합 하는 단위체 avidin 장식 BCG에 의해 유도 된 저것과 유사한 면역 반응을 일으킬 수 있다 유전으로 동일한 항 원 표현 둘 다 생체 외에서 그리고 에 비보. 이 기술은 세균성 표면에 관심사의 단백질의 가역 디스플레이의 따라서 전통적인 유전자 전송 접근법의 효과적인 보충 이며 BCG의 광범위 한 조작 및 백신에 추가 응용 프로그램을 위한 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 개발입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리 보고이 연구에서 외 인 단백질의 신속 하 고 효과적인 디스플레이 위한 비 유전 접근 특정 항 원 또는 효율적으로 박테리아의 immunogenicity를 향상 시킬 것으로 예상 하는 특정 기능 속성을 추가 하려면 BCG 표면에. 우리는 BCG 세포 표면 수 쉽게 avidin 퓨전 단백질 즉각적인 표면 장식 biotinylated 시연. 유전자 변환 및 긍정적인 클론의 선택 필요 시간 지연의 2 ~ 3 개월 동안 2 h 이내 총 절차를 수행할…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 기술 지원에 대 한 A. Talal 닥터 R 스톡 BCG 파스퇴르 스트레인에 대 한 감사합니다. 우리는 또한 유전자 합성에 대 한 GenScript을 감사합니다.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
Referências
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