Uttrykk for eksogene antigener i Mycobacterium bovis BCG vaksinen via ikke-genetiske overflaten dekorasjon med Avidin-biotin System
Summary
En ny teknikk for rask antigen visning på en bakteriell overflate presenteres, som innebærer overflate biotinylation etterfulgt av eksponering for proteiner interesse sammensmelting med monomerisk avidin. Lasting BCG valgte antigener vellykket forbedrer sin immunogenisitet, antyder at landtransport dekorasjon kan erstatte tradisjonelle genetisk tilnærminger.
Abstract
Tuberkulose (TB) er en alvorlige infeksjonssykdommer og kun tilgjengelig vaksine M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) er trygg og effektiv beskyttelse mot barn alvorlig TB hjernehinnebetennelse og noen former for spres TB, men ikke klarer å beskytte mot lunge TB, som er den mest utbredte sykdommen. Lovende strategier for å forbedre BCG nå stole på transformasjonen med gener som koder immunodominant M. tuberkulose (Mtb)-spesifikke antigener og/eller complementation med gener co-faktorer som vil stimulere antigen-koding presentere celler. Store begrensninger på disse inkluderer lav effektivitet, lav stabilitet og usikker nivået av sikkerhet for uttrykket vektorer. I denne studien presenterer vi en alternativ tilnærming til vaksine forbedring, som består av BCG complementation med ytre proteiner rundt på overflaten av bakterier, i stedet for transformasjon med Plasmidene koding tilsvarende gener. Først proteiner av interesse uttrykt i fusion med monomerisk avidin i standard E. coli uttrykk systemer og deretter brukes til å dekorere overflaten av biotinylated BCG. Dyreforsøk bruker BCG overflate dekorert med surrogat ovalbumin antigen viser at endrede bakterien er fullt immunogenic og kan indusere bestemt T celle svar. Dataene som presenteres her sterkt støtte helt, en roman og effektiv metode for omforme den gjeldende BCG-vaksinen som erstatter arbeidskrevende konvensjonell tilnærming til complementation med ytre nukleinsyrer.
Introduction
Ulike strategier har vært foreslått å erstatte gjeldende TB vaksinen BCG, inkludert protein adjuvant systemer, viral vectored teknologier, dempes live M.tb stammer og genmodifiserte BCG stammer, enten for å innføre gener over uttrykke BCG antigener som ikke er tilstrekkelig uttrykt under infeksjon1 eller Mtb-spesifikke antigener ikke finnes i BCG2. Genteknologi, men står overfor mange barrierer inkludert usikker sikkerhet, den tidkrevende prosessen og lav effektivitet av uttrykket vektorer4,5. Når det gjelder å forbedre BCG, er alternativ metode nødvendig for å forbedre immunogenisitet uten behov for usikker genetisk alternations.
I denne studien introduserer vi en ny strategi for visning av rekombinante proteinene rundt på BCG cellens overflate som er basert på den velkjente høy affinity avidin interaksjonen med biotin. Denne fremgangsmåten kan rask og reproduserbar vedlegg av rekombinant avidin fusion protein på overflaten av biotinylated BCG, som muliggjør bred manipulasjoner av BCG å oppnå maksimal forbedring av effekt samtidig opprettholde sin utmerkede sikkerhet registrere, observert over tiår med bruk.
Avidin affinitet for biotin er ekstremt høy (Kd = 10−15 M) og når dannet, biotin-avidin komplekset er meget stabil og kan bare bli forstyrret under denaturing forhold6. Men for denne type samhandling som et gen overføring metoden alternativ, er langsiktig men reversibel visning av rekombinante proteinene nødvendig. Derfor introduserte vi her en lav affinitet monomerisk avidin (Kd = 10−7 M) som fører til reversibel utgivelsen av protein fra overflaten dekorert BCG når inntatt i antigen presentere celler. For å gi et bevis på konseptet, testet vi denne metoden bruker en monomerisk avidin chimeric protein tilsvarer en surrogat antigen avledet fra ovalbumin (OVA)7,8. Resultatene viste at celleoverflaten BCG kan være enkelt og raskt dekorert med monomerisk avidin fusion proteiner og at denne bindingen til BCG overflaten er stabil og reproduserbar uten synlig endringer i bakterievekst og overlevelse. Også vi fant at BCG dekorert med monomerisk avidin smeltet sammen med OVA (AviOVA) kan indusere en immunrespons lik som indusert av BCG genetisk uttrykke samme antigen både i vitro og i vivo. Denne teknologien av reversibel proteiner av interesse på bakteriell overflaten er derfor en effektiv erstatning av tradisjonelle genet overføring og gir en plattform for bred manipulasjoner av BCG og videre søknader i vaksine utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi rapporterte i denne studien en ikke-genetiske tilnærming for rask og effektiv visning av eksogene proteiner på BCG overflaten til bestemte antigener eller bestemte funksjonelle egenskaper forventes å effektivt forbedre den bakterien immunogenisitet. Vi viste at celleoverflaten BCG kan være lett biotinylated for øyeblikkelig landtransport dekorasjon med avidin fusion proteiner. Totalt prosedyren kan utføres innen 2 timer, mens genetisk transformasjon og utvalg av positiv kloner krever 2 til 3 måneder av tidsfors…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. R Stokes for BCG Pasteur belastningen og A. Talal kundestøtte. Vi har også takke GenScript for hjelp med Gen syntese.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
Referências
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
