Uttryck av exogena antigen i Mycobacterium bovis BCG vaccinet via icke-genetiska yta dekoration med metoden-biotin systemet
Summary
Ny teknik för snabb antigen visning på en bakteriell yta presenteras, som innebär att ytan biotinylation följt av exponering för proteiner av intresse i fusion med monomer metoden. Laddar BCG med valda antigener framgångsrikt förbättrar dess immunogenicitet, vilket tyder på att ytan dekoration kan ersätta traditionella genetiska metoder.
Abstract
Tuberkulos (tbc) är en allvarlig infektionssjukdom och den enda tillgängliga vaccin M. bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG) är säkra och effektiva skyddsåtgärder mot barnens svåra TB meningit och vissa former av disseminerad TB, men misslyckas med att skydda mot pulmonell tuberkulos, som är den vanligaste formen av sjukdomen. Lovande strategier för att förbättra BCG för närvarande förlitar sig antingen på sin omvandling med gener som kodar för immundominant M. tuberkulos (Mtb)-specifika antigener eller komplettering med gener som kodar för co-faktorer som skulle stimulera antigen presenterande celler. Stora begränsningar för dessa metoder inkluderar låg effektivitet, låg stabilitet och den osäkra säkerhetsnivån av uttrycket vektorer. I denna studie presenterar vi ett alternativ till vaccin förbättring, som består av BCG komplettering med exogena proteiner av intresse på ytan av bakterier, i stället för transformation med plasmider kodning motsvarande gener. Först, proteiner av intresse uttrycks i fusion med monomer metoden i standard E. coli uttryck system och sedan används för att dekorera ytan av biotinylerade BCG. Djurförsök med BCG surface dekorerad med surrogat äggalbumin antigen Visa att den modifierade bakterien fullt immunogent och kan framkalla specifika T-cell svar. Sammantaget stöder de data som presenteras här starkt en ny och effektiv metod för att omforma den nuvarande BCG-vaccination som ersätter den mödosamma konventionell metoden av komplettering med exogena nukleinsyror.
Introduction
Olika strategier har föreslagits att ersätta nuvarande TB Vaccinet BCG, inklusive protein adjuvant system, viral vektoriserade teknik, försvagat levande M.tb stammar och genetiskt modifierade BCG stammar, antingen för att introducera gener över uttrycker BCG antigener som inte uttrycks tillräckligt under infektion1 eller Mtb-specifika antigener inte förekommer i BCG2. Genteknik, står dock inför många hinder inklusive osäker nivå av säkerhet, tidsödande och låga effektivitet av uttrycket vektorer4,5. När det gäller att förbättra BCG, behövs en alternativ metod att förbättra immunogenicitet utan behov av osäkra genetiska växlingen.
I denna studie introducerar vi en ny strategi för visning av rekombinanta proteiner av intresse på BCG cellytan som baseras på välkända hög affinitet metoden interaktionen med biotin. Denna metod tillåter snabba och reproducerbara fastsättning av rekombinant avidinen fusionsproteiner på ytan av biotinylerade BCG, vilket underlättar bred manipulationer av BCG att uppnå maximal förbättring av dess effektivitet samtidigt som dess utmärkt säkerhet rekord, observerade under decennier av användning.
Avidinen affinitet för biotin är extremt hög (Kd = 10−15 M) och en gång bildats, biotin-avidinen komplexet är mycket stabil och kan endast störas under denatureringen villkor6. För denna typ av interaktion att fungera som en gen överföring metod alternativ, krävs dock långsiktigt men reversibel visning av rekombinanta proteiner. Således, introducerade vi här en låg affinitet monomer metoden (Kd = 10−7 M) som leder till reversibel frisläppandet av protein från ytan inredda BCG intas en gång inuti antigenpresenterande celler. För att ge ett proof of concept, testade vi denna metod använder en monomer metoden chimära protein motsvarar ett surrogat antigen härrör från äggalbumin (OVA)7,8. Resultaten visade att BCG cellens yta kan vara snabbt och enkelt dekorerad med monomer metoden fusionsproteinerna och att denna bindning till BCG ytan är stabila och reproducerbara utan påvisbara förändringar i bakteriell tillväxt och överlevnad. Också, Vi hittade att BCG dekorerad med monomer avidinen smält med ägg (AviOVA) kan framkalla ett immunsvar som liknar den som induceras av BCG genetiskt uttrycker samma antigen både in vitro- och in vivo. Denna teknik av vändbar display av proteiner av intresse på bakteriell ytan är därför en effektiv ersättning av traditionella gen överföring tillvägagångssätt och kan tillhandahålla en plattform för bred manipulationer av BCG och mer ytterligare applikationer i vaccin utveckling.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie rapporterade vi en icke-genetiska strategi för snabb och effektiv visning av exogena proteiner på BCG yta att lägga till antingen specifika antigener eller specifika funktionella egenskaper förväntas effektivt förbättra bakteriens immunogenicitet. Vi visat att BCG cellytan kunde vara enkelt biotinylerade för momentana yta dekoration med metoden fusionsproteinerna. Den totala proceduren kan utföras inom 2 h, medan genetisk transformation och urval av positiva kloner kräver 2 till 3 månaders efter…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr. R Stokes för BCG Pasteur stammen och A. Talal för teknisk support. Vi tackar också GenScript för hjälp med gen syntes.
Materials
| Endotoxin-free RPMI 1640 | StemCell Technologies | 36750 | |
| Sulfo-NHS SS biotin | Thermo Fisher | 21328 | |
| FITC-conjugated streptavidin | Sigma-Aldrich | S3762 | |
| Phycoerythrin (PE)-conjugated I-Ab-OVA323-339 tetramer | MBL International | TS-M710-1 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| TALON polyhistidine-Tag purification resin | Clontech | 635501 | |
| Alexa Fluor (AF) 647 conjugated rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| AF647 rat anti-mouse IFN-g | BD Bioscience | 557735 | |
| AF647 rat anti-mouse I-A/I-E | BD Bioscience | 562367 | |
| PeCy7 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 552775 | |
| PE rat anti-mouse CD8 Ab | BD Bioscience | 561095 | |
| AF 647 rat anti-mouse H-2kb | BD Bioscience | 562832 | |
| FITC-conjugated goat anti rabbit antibody | Thermo Fisher | 31635 | |
| AF 647 rat anti-mouse CD4 | BD Bioscience | 557681 | |
| Ultra-small gold-conjugated goat anti-rabbit IgG | Electron Microscopy Sciences | 25100 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Diagnostic Systems | 271310 | |
| OADC | BD Diagnostic Systems | B11886 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| RAW 264.7 murine macrophage cell lines | American Type Culture Collection | ||
| pDEST17 plasmid | Invitrogen | 11803012 | |
| pUC57-OVA plasmid | GenScript | SD1176 | |
| BP clonase | Invitrogen | 11789020 | |
| LR clonase | Invitrogen | 11791043 | |
| pDONR221 plasmid | Invitrogen | 12536017 | |
| Ni-NTA columns | Qiagen | 31014 | |
| Pierce protein concentrators | Thermo Fisher | 88527 | |
| Flurosave | Calbiochem-Novabiochem | 345789 | |
| Axioplan II epifluorescence microscope | Carl Zeiss Inc | ||
| CCD digital camera | Retiga EX, QImaging | ||
| Tecnai G2 200kV electron microscope | FEI Company | G2 200Kv | |
| 70μm Falcon cell strainer | Thermo Fisher | 87712 | |
| EasyStep mouse biotin positive selection kit | StemCell | 18556 | |
| biotin-Ter119/Ertyroid cells antibody | BioLegend | 116203 | |
| Brefeldin A | BD Pharmingen | 555029 | |
| Cytofix/Cytoperm kit | BD Pharmingen | 554714 | |
| Bright-Glo Luciferase assay system | Promega | e2620 | |
| Turner Biosystem luminometer | Promega | TD-20/20 | |
| Leica EM UC6 microtome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Novalyphe NL 500 freeze dryer | Savant Instruments | NL 50 | |
| Wheaton boroscilicate glass vials | Wheaton | VWR 66011-675 |
Referências
- Horwitz, M. A., Harth, G. A new vaccine against tuberculosis affords greater survival after challenge than the current vaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis. Infect. Immun. 71 (4), 1672-1679 (2003).
- Pym, A. S., et al. Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection against tuberculosis. Nat Med. 9 (5), 548-553 (2003).
- Grode, L., et al. Increased vaccine efficacy against tuberculosis of recombinant Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin mutants that secrete listeriolysin. The J Clin Invest. 115 (9), 2472-2479 (2005).
- Bastos, R. G., Borsuk, S., Seixas, F. K., Dellagostin, O. A. Recombinant Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 27 (47), 6495-6503 (2009).
- Mederle, I., et al. Plasmidic versus insertional cloning of heterologous genes in Mycobacterium bovis BCG: impact on in vivo antigen persistence and immune responses. Infect Immun. 70 (1), 303-314 (2002).
- Singh, N. P., et al. A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity A Novel Approach to Cancer Immunotherapy Tumor Cells Decorated with CD80 Generate Effective Antitumor Immunity. Cancer Res. 63 (14), 4067-4073 (2003).
- Oizumi, S., Strbo, N., Pahwa, S., Deyev, V., Podack, E. R. Molecular and cellular requirements for enhanced antigen cross-presentation to CD8 cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 179 (4), 2310-2317 (2007).
- Sharif-Paghaleh, E., et al. Monitoring the efficacy of dendritic cell vaccination by early detection of (99m) Tc-HMPAO-labelled CD4(+) T cells. Eur J Immunol. 44 (7), 2188-2191 (2014).
- Sun, J., et al. A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria. Plasmid. 62 (3), 158-165 (2009).
- Laitinen, O. H., et al. Rational design of an active avidin monomer. J. Biol. Chem. 278 (6), 4010-4014 (2003).
- Flynn, J. L., Chan, J., Triebold, K. J., Dalton, D. K., Stewart, T. A., Bloom, B. R. An essential role for interferon gamma in resistance to Mycobacterium tuberculosis infection. J Exp Med. 178 (6), 2249-2254 (1993).
- Liao, T. Y. A., Lau, A., Joseph, S., Hytonen, V., Hmama, Z. Improving the immunogenicity of the Mycobacterium bovis BCG vaccine by non-genetic bacterial surface decoration using the avidin-biotin system. PLoS ONE. 10 (12), e0145833 (2015).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. PNAS. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Lesch, H. P., Kaikkonen, M. U., Pikkarainen, J. T., Yla-Herttuala, S. Avidin-biotin technology in targeted therapy. Expert Opin Drug Deliv. 7 (5), 551-564 (2010).
- Paganelli, G., Bartolomei, M., Grana, C., Ferrari, M., Rocca, P., Chinol, M. Radioimmunotherapy of brain tumor. Neurol Res. 28 (5), 518-522 (2006).
- Cummings, J. F., et al. Safety and immunogenicity of a plant-produced recombinant monomer hemagglutinin-based influenza vaccine derived from influenza A (H1N1)pdm09 virus: a Phase 1 dose-escalation study in healthy adults. Vaccine. 32 (19), 2251-2259 (2014).
- Kolotilin, I., et al. Plant-based solutions for veterinary immunotherapeutics and prophylactics. Vet Res. 45, 114-117 (2014).
- Demonte, D., Drake, E. J., Lim, K. H., Gulick, A. M., Park, S. Structure-based engineering of streptavidin monomer with a reduced biotin dissociation rate. Proteins. 81 (9), 1621-1633 (2013).
- Deghmane, A. E., et al. Lipoamide dehydrogenase mediates retention of coronin-1 on BCG vacuoles, leading to arrest in phagosome maturation. J Cell Sci. 120 (19), 3489-3489 (2007).
- Soualhine, H., et al. Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin secreting active cathepsin S stimulates expression of mature MHC class II molecules and antigen presentation in human macrophages. J Immunol. 179 (8), 5137-5145 (2007).
- Bubb, M. O., Green, F., Conradie, J. D., Tchernyshev, B., Bayer, E. A., Wilchek, M. Natural antibodies to avidin in human serum. ImmunolLett. 35 (3), 277-280 (1993).
- Petronzelli, F., et al. Therapeutic use of avidin is not hampered by antiavidin antibodies in humans. Cancer Biother Radiopharm. 25 (5), 563-570 (2010).
- Bigini, P., et al. In vivo fate of avidin-nucleic acid nanoassemblies as multifunctional diagnostic tools. ACS Nano. 8 (1), 175-187 (2014).
