פיתוח assay על כימות תוכן גבוהה של היווצרות צבירה של מוטציה בחלבון Sod1 בתאים חיים
Summary
אנו מתארים שיטה לכמת את המצבור של חלבונים misfolded. פרטי פרוטוקול שלנו lentiviral המושרה תא יציב קו הדור הדמיה קונאפוקלית אוטומטיות, ניתוח תמונות של אגרגטים חלבון. כיישום המחשה, למדנו את ההשפעה של מולקולות קטנות בקידום SOD1 צבירת באופן זמן ותלוי במינון.
Abstract
נוירודגנרטיביות (ALS) היא מחלה קטלנית ניווניות יכול להיגרם על-ידי מוטציות בירושה ג’ין קידוד אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז 1 (SOD1). את חוסר היציבות מבנית של SOD1, זיהוי תכלילים SOD1-חיוביות בחולי ALS משפחתית תומכת תפקיד סיבתי פוטנציאליים עבור SOD1 misfolded ו/או צבורים בפתולוגיה ALS. במחקר זה, אנו מתארים את התפתחות assay מבוססת תא שעיצב לכמת את הדינמיקה של צבירת SOD1 בתאים חיים תכולה גבוהה ההקרנה גישות. באמצעות וקטורים lentiviral, יצרנו שורות תאים יציב לבטא פראי-סוג של מוטציה SOD1 A4V עם חלבון פלואורסצנטי צהוב התגית ומצא כי שני חלבונים היו לידי ביטוי ציטוזול בלי שום סימן של מצבור. מעניין, רק SOD1 A4V stably לידי ביטוי HEK-293, אבל לא בשורות תאים U2OS או SH-SY5Y, יצרו אגרגטים על טיפול מעכבי פרוטאוזום. אנו מראים שאפשר לכמת צבירת מבוסס על ניתוח מנה-תגובה של מעכבי פרוטאוזום שונים, וכדי לעקוב אחר קינטיקה צבירה-היווצרות על ידי מיקרוסקופ זמן לשגות. הגישה שלנו מציג את האפשרות של לכימות ההשפעה של מוטציות ALS על עצמו את התפקיד של SOD1 במבנה הצבירה, כמו גם הקרנת עבור מולקולות קטנות למנוע צבירת SOD1 A4V.
Introduction
צבירת חלבון היא תהליך ביולוגי שבו misfolded קבוצת חלבונים את רשאית לפעול כסוכני סיבתי מחלות ניווניות (עמילואידוזיס). אפיון צבירת חלבון חיוני להבין את התפקיד של אגרגטים הסלולר בתפקוד לקוי גם הכוונה להקל על גילוי חדש גורמים המשפיעים על הופעת המחלה. הפריט החזותי של קרינה פלואורסצנטית מתויג חלבונים בתאים חיים היא שיטה חזקה אשר עשויים לסייע בפיתוח של מבחני החלים על תכולה גבוהה הקרנת3,2,1,(HCS)4.
נוירודגנרטיביות (ALS) נחשבת מחלה proteopathic הנגרמת על ידי נוכחותם של חלבונים misfolded עם נטיה לצבור ולצבור בנוירונים מנוע ALS משפחתית (fALS) והן סדיר ALS (sALS)5,6 . תת-קבוצה של ~ 20% מהמקרים fALS קשורים עם דומיננטי מוטציות בגן קידוד האנזים נוגד חמצון cytosolic אבץ נחושת סופראוקסיד דיסמוטאז להקליד (SOD1) 17,8. הוצעו מספר סיבות פוטנציאליות בתפקוד נגזר גנטית זו, לרבות שינויים המבנה והתפקוד של SOD1 משתנים, כגון יציבות סוטה, קצב התגלגלות מוגבר נטיה לצבור9, 10. ראוי לציין, המאפיין היחידי מאומת, רעיל המשותפים לשני החלקים SOD1 מקושרים-ALS ופראי-סוג (WT) SOD1 היא נטיה מוגברת אגרגטים חלבון ממודר או הכללות proteinaceous11,12 . מוטציה misfolded SOD1, בהתמדה polyubiquitinated, מושפל על ידי מערכת אוביקוויטין-פרוטאוזום. כתוצאה מכך, רמה נמוכה של עיכוב פרוטאוזום הפעילות מוביל להצטברות של SOD1 אגרגטים13,14, מבנים אמורפיים איזה טופס המורכבת מרכיבים מסיסים שבו אפשר להחליף עם מוטציה מסיסים SOD1 המוטנט ציטוזול15. ב בפרט, SOD1 המוטנט A4V (אלנין-codon 4 שינתה ולין) המוטציה השכיחה ביותר הגורמים ALS, והוא מוביל הקשורים ניוון מוחיים מהירה עם מועד הישרדות ממוצע של פחות משנתיים לאחר התפרצות המחלה16. מבחינה ביוכימית, SOD1 A4V יש נטייה מוגברת monomerize, צבירה, ויוצרים נקבוביות עמילואיד; אגרגטים כמו נקבוביות שלה דומים נקבוביות עמילואיד מקושרים-מחלת מוטציה צורות אחרות, כגון חלבון α synuclein וβ-עמילואיד17. ללמוד את הדינמיקה של הצטברות SOD1 צבירה, שיטות לניטור מסיסים ובחלקם לא מסיסים SOD1 צבירה טפסים להישאר להיות מפותח.
הראינו בעבר, באמצעות הדמיה לחיות תאים, התאים HEK-293 transiently transfected עם פלורסנט SOD1 מתויג חלבון, כי מוטציות הקשורות ALS לפגום dimerization של צבירת SOD111. למרות מערכות ביטוי ארעי יכול לספק מידע שימושי על התוצאה הביולוגי של ביטוי גנים לטווח קצר, שיטות מתן יציב שילוב של גנים הרצוי עשוי להיות מועדפת לפיתוח וזמינותו. ככזה, וקטורים lentiviral מציעים את היכולת להתייעץ ביטוי גנים לטווח ארוך ומוסדרת על תאים בתרבית של 18. במחקר זה, התמקדנו הדור של שורות תאים יציב transduced עם lentivirus רקומביננטי הנושאת WT ו מתויג SOD1 המוטנט עם חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לחיות תאים כימות אוטומטיות של צבירת SOD1, אנו מופעלות, לכמת SOD1 צבירת להתרחשויות עיכוב של פרוטאוזום.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנן שתי גישות עיקריות ליצירת שורות תאים יציב. הראשון לוקח מספר שבועות ומחייב בחירה תרביות תאים והתנגדות ארעית של הווקטורים דנ א גנומי פלסמיד משולב. השני לוקח שעות באמצעות lentivirus, ביצוע פרוטוקול זה נוטה הביטוי יעיל של חלבון המטרה שורות תאים מרובים עם מאמץ מוגבל. הטיול-CMV וקטור19…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP) (ה-NRF-2014K1A4A7A01074642), והתוכנית הלאומית מחקר קרן של קוריאה (NRF) מדען בודדים תמיכה (ה-NRF-2013M3A9B5076486/ה-NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Referências
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington’s disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer’s disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?. J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a., et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
