يصف لنا طريقة للتحديد الكمي لتجميع البروتينات تجمعات. لدينا تفاصيل البروتوكول لينتيفيرال الناجمة عن توليد خط الخلية مستقرة والتصوير الآلي [كنفوكل]، وتحليل الصور من المجاميع البروتين. كتطبيق توضيحية، قمنا بدراسة تأثير الجزيئات الصغيرة في تشجيع تجميع SOD1 بطريقة تعتمد على وقت وجرعة.
التصلب العضلي الجانبي (المرض) هو مرض الأعصاب قاتلة التي يمكن أن تسببها الطفرات موروثة في الجينات ترميز فائق أكسيد النحاس والزنك الفاءق 1 (SOD1). حالة عدم الاستقرار الهيكلي من SOD1 والكشف عن تضمينات SOD1 إيجابية في المرضى الذين يعانون المرض الأسرية تؤيد دور سببية محتملة SOD1 تجمعات و/أو مجمعة في باثولوجيا المرض. في هذه الدراسة، يصف لنا تطوير التحليل يستند إلى الخلية مصممة لقياس القوى المحركة لتجميع SOD1 في الخلايا الحية بالمحتوى العالي من فحص النهج. استخدام ناقلات لينتيفيرال، ونحن إنشاء خطوط الخلايا مستقر معربا عن SOD1 A4V البرية من نوع ومتحولة معلم مع بروتين فلوري الصفراء، وتبين أن كلا من البروتينات وأبديت في سيتوسول دون أي بادرة للتجميع. من المثير للاهتمام، فقط SOD1 A4V ستابلي المعرب عنها في HEK-293، ولكن ليس في خطوط الخلايا U2OS أو SY5Y ش، شكلت المجاميع عند بروتوزوم مثبط للعلاج. ونحن تبين أنه من الممكن للتحديد الكمي للتجميع على أساس تحليل الجرعة والاستجابة لمختلف بروتوزوم مثبطات، وتتبع الحركية الكلية لتشكيل بالوقت الفاصل بين الفحص المجهري. ويدخل نهجنا إمكانية التحديد الكمي لأثر حدوث طفرات المرض على الدور SOD1 في تشكيل إجمالي، فضلا عن الكشف عن الجزيئات الصغيرة التي تحول دون تجميع SOD1 A4V.
يتم تجميع البروتين تجمعات مجموعة البروتينات تصل عملية بيولوجية من خلالها وقد تكون بمثابة العوامل المسببة في أمراض الأعصاب (الداء النشواني). وصف تجميع البروتين ضروري لفهم دور المجاميع في خلل الخلوية، وكذلك كما هو الحال في تسهيل اكتشاف العوامل الجديدة التي تؤثر في ظهور الأمراض. التصور من معلم fluorescence البروتينات في الخلايا الحية هي طريقة قوية والتي قد تساعد في تطوير فحوصات تنطبق على المحتوى العالي من الفحص (HCS)1،2،،من34.
ويعتبر التصلب العضلي الجانبي (المرض) مرض بروتيوباثيك الناجمة عن وجود تجمعات البروتينات مع الميل إلى تجميع وتتراكم في الخلايا العصبية الحركية في ALS الأسرية (مارا) ومتفرقة ALS (قرضاً)5،6 . وترتبط مجموعة فرعية من ~ 20% حالات مارا مع المهيمنة الطفرات في الجينات ترميز الإنزيم سيتوسوليك المضادة للأكسدة اكتب الفاءق فائق أكسيد النحاس والزنك (SOD1) 17،8. قد اقترحت العديد من الأسباب المحتملة لهذا الخلل وراثيا المشتقة، بما في ذلك التغيرات في هيكل ووظيفة SOD1 المتغيرات، مثل الاستقرار الشاذة، وزيادة معدل تطور، والميل إلى إجمالي9، 10. جدير بالذكر أن الخاصية تم التحقق منها ويمكن أن تكون سامة فقط مشتركة بين كلا الخيارين SOD1 المرتبطة بالمرض والبرية من نوع (WT) SOD1 ميل المتزايد إلى تشكيل المجاميع البروتين مجزأة أو تضمينات البروتينية11،12 . هو إصرار بوليوبيكويتيناتيد المسخ تجمعات SOD1، وتدهورت بسبب نظام ubiquitin-بروتوزوم. نتيجة لذلك على مستوى منخفض من تثبيط النشاط بروتوزوم يؤدي إلى تراكم متحولة SOD1 المجاميع13،14، أي تشكيل هياكل غير متبلور تتألف من مكونات قابلة للذوبان التي يمكن أن تتبادل مع القابلة للذوبان متحولة SOD1 في سيتوسول15. في طافرة SOD1 خاصة، A4V (ألانين في كودون 4 تغيرت إلى فالين) هو الطفرة المسببة للمرض الأكثر شيوعاً، ويؤدي إلى نيوروديجينيريشن السريع مع وقت متوسط البقاء على قيد الحياة أقل من 2 سنوات بعد ظهور المرض16. وقد SOD1 A4V المتحلل، ميل متزايد مونوميريزي وتجميعها وتشكيل المسام اميلويد؛ تتشابه مجاميعه مثل المسام المسام اميلويد أخرى أشكال سلاحف المرتبطة بالمرض، مثل α-سينوكلين وبيتا-اميلويد بروتين17. دراسة ديناميات تراكم SOD1 المجمعة، تظل أساليب لرصد أشكال SOD1 الإجمالية القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان التي ستوضع.
أننا أظهرنا سابقا، باستخدام التصوير بخلية يعيش و transfected الخلايا HEK-293 عابر مع نيون SOD1 معلم البروتين، أن الطفرات المرتبطة بالمرض يضر SOD1 ثنائي وتجميع11. على الرغم من أن أنظمة تعبير عابر يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن نتائج قصيرة الأجل الجينات overexpression البيولوجية، قد تكون أساليب توفير تكامل مستقرة من الجينات المرغوبة المفضل للتنمية المقايسة. على هذا النحو، تقدم ناقلات لينتيفيرال القدرة على إضفاء تعبير الجينات الطويلة الأجل والتنظيم في خلايا الثدييات 18. في هذه الدراسة، ركزنا على توليد خطوط الخلايا مستقرة ترانسدوسيد مع المؤتلف lentivirus تحمل وزن والمسخ SOD1 المفتاحية بروتين فلوري الصفراء (يفب). استخدام خلية يعيش التصوير المجهري والكمي الآلي لتجميع SOD1، آثار وكمياً SOD1 تجميع الأحداث على تثبيط بروتوزوم.
وهناك نهجين رئيسيين لتوليد خطوط الخلايا مستقرة. يستغرق عدة أسابيع الأولى ويتطلب التحديد تعداء ومقاومة عابرة موجهات الدنا الجينومي بلازميد المتكاملة. الثاني يأخذ بضع ساعات من خلال استخدام lentivirus، مما يجعل هذا البروتوكول قابلاً للتعبير الفعال عن البروتين المستهدف في عدة أسطر الخلية مع جهد…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل بمنحه ممولة من الحكومة الكورية (مسيب) (جبهة الخلاص الوطني-2014K1A4A7A01074642)، وبرنامج دعم العلماء الفردية الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) (جبهة الخلاص الوطني-2013M3A9B5076486/جبهة الخلاص الوطني-2015R1D1A1A09057239).
ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |