살아있는 세포에 Sod1 돌연변이 단백질 집계 형성의 높은 콘텐츠 정량화에 대 한 분석 결과 개발
Summary
계량 misfolded 단백질의 집계 하는 방법을 설명 합니다. 우리의 프로토콜 세부 사항을 lentiviral 안정적인 셀 라인 생성, 자동된 confocal 영상, 및 단백질의 이미지 분석을 유도 한다. 설명 응용 프로그램으로 우리는 SOD1 집계 시간 복용량에 따라 방식에서 홍보에 작은 분자의 효과 공부 했습니다.
Abstract
루 경화 증 (ALS) 유전자 인코딩 구리-아연 superoxide dismutase 1 (SOD1)에서 상속 된 돌연변이 의해 발생할 수 있는 치명적인 신경 질환 이다. SOD1의 구조적 불안정 및 가족 ALS 환자에 SOD1 긍정적인 포함 검색 misfolded 또는 집계 SOD1 ALS 병 리에 대 한 잠재적인 원인 역할을 지원합니다. 이 연구에서 우리는 높은 콘텐츠 접근을 차단 하 여 살아있는 세포에 SOD1 집계의 역학을 계량 하도록 세포 기반 분석 결과의 개발을 설명 합니다. 안정적인 셀 라인 표현 야생-타입 및 돌연변이 A4V SOD1 태그로 노란 형광 성 단백질 및 두 단백질 집단의 흔적 없이 cytosol에 표현 되었다 발견 lentiviral 벡터를 사용 하 여 생성 되었습니다. 흥미롭게도,만 SOD1 A4V HEK 293 안정적으로 표현 하지만 하지 U2OS 또는 SH SY5Y 셀 라인에 프로테아좀 억제제 처리 시 집계를 형성 했다. 우리는 다양 한 프로테아좀 억제제의 복용량 응답 분석을 기반으로 집계를 계량 하 고 시간 경과 현미경 검사 법에 의해 집계 형성 속도 론을 추적 가능 하다는 것을 보여줍니다. 우리의 접근 ALS 돌연변이의 역할에 SOD1 집계 형성에 효과 측정 SOD1 A4V 집계를 방지 하는 작은 분자에 대 한 심사의 가능성을 소개 합니다.
Introduction
단백질 집계는 생물학 과정을 단백질 그룹을 misfolded 및 신경 퇴행 성 질환 (amyloidosis)에 원인이 되는 에이전트 역할을 할 수는 있습니다. 단백질 집계 특성화 촉진은 병의 발병에 영향을 주는 새로운 요인의 발견에서 세포 장애 뿐만 집계의 역할 이해에 필수적 이다. 살아있는 세포에 형광 태그 단백질의 시각화 높은 콘텐츠 심사 (HCS)1,2,,34에 적용 가능한 분석 실험의 개발에 도움이 수 있는 강력한 방법입니다.
루 경화 증 (ALS) 집계 가족 ALS (fALS)에 산발적 ALS (염)5,6 모터 신경에서 축적 하는 성향으로 misfolded 단백질의 존재로 인 한 proteopathic 질병으로 간주 됩니다. . FALS 경우의 ~ 20%의 하위 집합 관련 된 인코딩 cytosolic 항 산화 효소 유전자에 지배적인 돌연변이와 구리-아연 superoxide dismutase 입력 1 (SOD1)7,8. SOD1 변형, 탈 선 안정성, 증가 전개 속도, 집계9, 성향 등의 기능과 구조에 변화를 포함 하 여이 유전자 파생된 전에 대 한 몇 가지 잠재적인 원인 제안 되었습니다. 10. 특히, 두 ALS 연결 된 SOD1 이체에 의해 공유 하는 유일한 확인 하 고 잠재적으로 유독한 속성 이며 야생-타입 (WT) SOD1 compartmentalized 단백질 집계 또는 배치할 포함11,12 형태로 증가 성향 . Misfolded 돌연변이 체 SOD1, 지속적으로 polyubiquitinated 이며, 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해 타락. 그 결과, 프로테아좀의 활동의 억제의 저수준 SOD1 집계13,14, 수용 성 돌연변이 체 SOD1와 교환할 수 있는 수용 성 구성 요소 형태로 비정 질 구조를 구성 하는 돌연변이의 축적에 리드 cytosol15. 특히, SOD1 돌연변이 A4V에서 (알라닌 codon 4에서 valine 변경) 가장 일반적인 ALS를 일으키는 돌연변이 이며 2 년 미만 질병 발병16후의 평균 생존 시간 빠른 neurodegeneration을 리드. 화학적, SOD1 A4V monomerize, 집계, 녹말 체 모;를 형성 하는 증가 경향이 있다 그것의 기 공 같은 집계 다른 질병에 연결 된 돌연변이 형태, α-synuclein와 β 아 밀 로이드 단백질17등의 녹말 체 모와 비슷합니다. SOD1 집계 축적의 역학 연구, 가용성과 불용 성 SOD1 집계 형태를 모니터링 하기 위한 방법 개발 유지.
우리는 이전, 라이브 셀 이미징 사용 하 여 및 HEK 293 세포 형광 단백질 태그 SOD1, ALS 관련 돌연변이 SOD1 이합체 화 및 집계11손상으로 뚜렷이 페. 과도 식 시스템 단기 유전자 overexpression의 생물 학적 결과 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다, 방법 원하는 유전자의 안정적인 통합을 제공 하는 분석 결과 개발에 대 한 선호 있을 수 있습니다. 따라서, lentiviral 벡터 포유류 세포 18에 장기 및 규제 유전자 발현을 부여 하는 기능을 제공 합니다. 이 연구에서 우리가 재조합 lentivirus WT 베어링으로 불리고 안정적인 셀 라인의 세대에 집중 하 고 돌연변이 체 SOD1 태그 노란 형광 성 단백질 (YFP)와. 라이브 셀 이미징 현미경 SOD1 집계의 자동화 된 정량화에 사용 하 여, 우리는 실행 하 고 SOD1 집계 이벤트는 프로테아좀의 억제 시 계량.
Protocol
Representative Results
Discussion
안정적인 세포를 생성 하기 위한 두 가지 주요 방법 있다. 처음 몇 주를 소요 하며 게놈 통합된 플라스 미드 DNA 벡터의 과도 transfection 및 저항 선택. 두 번째는 제한 노력으로 여러 셀 라인에서이 프로토콜을 대상 단백질의 효과적인 표현 의무가 만들기 lentivirus, 사용 시간의 문제를 걸립니다. 여행-CMV 벡터19 지속적인된 벡터 보존된 변환 효율과 안정적인 transgene 식 사용 했다. 놀?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 한국 정부 (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642), 한국 국가 연구 재단 (NRF) 개별 과학자 지원 프로그램 (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239)에 의해 투자 된 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Referências
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