Assay udvikling for høje indhold kvantificering af Sod1 Mutant Protein samlede dannelse i levende celler
Summary
Vi beskriver en metode til at kvantificere sammenlægning af fejlfoldede proteiner. Vores lentiviral protokoloplysninger induceret stabil celle linje generation, automatiseret Konfokal imaging og billedanalyse af protein aggregater. Som et vejledende program undersøgte vi effekten af små molekyler i at fremme SOD1 akkumulering i en tid – og dosisafhængig måde.
Abstract
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) er en dødelig neurodegenerativ sygdom, der kan være forårsaget af nedarvede mutationer i genet kodning kobber-zink superoxiddismutase 1 (SOD1). Den strukturelle ustabilitet i SOD1 og påvisning af SOD1-positive optagelser i familiær ALS patienter understøtter en potentiel kausal rolle for fejlfoldede og/eller aggregerede SOD1 i ALS patologi. I denne undersøgelse beskriver vi udviklingen af en celle-baserede assay designet til at kvantificere dynamikken i SOD1 aggregation i levende celler ved høje indhold screening tilgange. Bruger lentiviral vektorer, genereret vi stabil cellelinjer udtrykker vildtype og mutant A4V SOD1 markeret med gult fluorescerende proteiner og fandt, at begge proteiner blev udtrykt i cytosol uden nogen tegn på akkumulering. Interessant, kun SOD1 A4V udtrykt stabilt i HEK-293, men i U2OS eller SH-SY5Y cellelinjer, dannede ikke aggregater på proteasom hæmmer behandling. Vi viser, at det er muligt at kvantificere sammenlægning baseret på dosis-respons analyser af forskellige proteasom hæmmere og spore aggregat-dannelsen kinetik af time-lapse mikroskopi. Vores tilgang indfører mulighed for at kvantificere effekten af ALS mutationer på rollen af SOD1 i samlede dannelse samt screening for små molekyler, der forhindrer SOD1 A4V sammenlægning.
Introduction
Protein sammenlægning er en biologisk proces hvorved fejlfoldede proteiner gruppe op og kan fungere som sygdomsfremkaldende agenser i neurodegenerative sygdomme (amyloidose). Kendetegner protein sammenlægning er afgørende i forståelsen af aggregater i cellulære dysfunktion såvel som i at lette opdagelsen af nye faktorer, der påvirker udbrud af patologi rolle. Visualisering af fluorescens-tagged proteiner i levende celler er en kraftfuld metode, som kan støtte i udviklingen af assays gælder for højt indhold af screening (HCS)1,2,3,4.
Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) betragtes som en proteopathic sygdom forårsaget af tilstedeværelsen af fejlfoldede proteiner med tilbøjelighed til at aggregere og ophobe sig i motoriske neuroner i både familiær ALS (fALS) og sporadiske ALS (sALS)5,6 . En delmængde af ~ 20% af fALS tilfælde er associeret med dominerende mutationer i det gen, der koder cytosole antioxidant enzymet superoxiddismutase kobber-zink type 1 (SOD1)7,8. Flere mulige årsager til denne genetisk afledte dysfunktion har været foreslået, herunder ændringer i struktur og funktion af SOD1 varianter, som afvigende stabilitet, øget udfoldelsen sats og tilbøjelighed til samlede9, 10. Især, den eneste verificerede og potentielt giftige egenskab deles af begge ALS-knyttet SOD1 varianter og wild-type (WT) SOD1 er en øget tilbøjelighed til at danne opdelte protein aggregater eller proteinholdige indeslutninger11,12 . Fejlfoldede mutant SOD1, er vedvarende polyubiquitinated og nedbrudt af ubiquitin-proteasom system. Som et resultat, fører et lavt niveau af hæmning af proteasom aktivitet til ophobning af mutant SOD1 aggregater13,14, hvilken form amorfe strukturer sammensat af opløselige komponenter, der kan udveksle med opløselige mutant SOD1 i cytosol15. I særdeleshed SOD1 mutant A4V (alanin på codon 4 ændret til valin) er den mest almindelige ALS-forårsager mutation, og fører til hurtige neurodegeneration med en gennemsnitlige overlevelsestid på mindre end 2 år efter sygdom udbrud16. Biokemisk, har SOD1 A4V en øget tendens til monomerize, samler og danne amyloid porer; dens pore-lignende aggregater ligner amyloid porerne i andre sygdom-linked mutante former, såsom α-synuclein og β-amyloid protein17. For at studere dynamikken i SOD1-samlet ophobning, fortsat metoder til overvågning af opløselige og uopløselige SOD1 samlede former skal udvikles.
Vi har tidligere vist, ved hjælp af live-celle imaging og HEK-293 celler transfekteret forbigående med fluorescerende proteiner-markeret SOD1, at ALS-associerede mutationer forringe SOD1 dimerization og sammenlægning11. Selv om forbigående udtryk systemer kan give nyttige oplysninger om de biologiske resultatet af kortsigtede gen overekspression, kan metoder giver stabil integration af ønskede gener være foretrukne til assay udvikling. Som sådan tilbyder lentiviral vektorer muligheden for at overdrage langsigtede og regulerede genekspression pattedyrceller 18. I denne undersøgelse, vi fokuserede på generation af stabil cellelinjer transduced med rekombinant lentivirus forsynet med WT og mutant SOD1 markeret med gult fluorescerende proteiner (YFP). Ved hjælp af live-celle imaging mikroskopi og automatiseret kvantificering af SOD1 sammenlægning, vi udløst og kvantificeret SOD1 sammenlægning begivenheder ved hæmning af proteasom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er to primære metoder til at generere stabile cellelinjer. Først tager flere uger og kræver forbigående Transfektion og modstand udvalg af genomisk integreret plasmid DNA vektorer. Andet tager et spørgsmål om timer ved hjælp af lentivirus, hvilket gør denne protokol imødekommenhed over for den effektive udtryk for target protein i flere cellelinjer med en begrænset indsats. TUR-CMV vektor19 blev en vedvarende vektor til brug, med bevaret transduktion effektivitet og stabil transgen u…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et tilskud, der finansieres af den koreanske regering (MSIP) (NRF-2014K1A4A7A01074642) og National Research Foundation af Korea (NRF) individuelle videnskabsmand supportprogram (NRF-2013M3A9B5076486/NRF-2015R1D1A1A09057239).
Materials
| ALLN (C20H37N3O4) | Millipore | 208719 | |
| MG132 (C26H41N3O5) | Sigma-Aldrich | C2211 | |
| Epoxomicin (C28H50N4O7) | Sigma-Aldrich | E3652 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 | |
| Opera | Perkin Elmer | OP-QEHS-01 | |
| Opera EvoShell software | Perkin Elmer | Ver 1.8.1 | |
| Operetta | Perkin Elmer | OPRT1288 | |
| Harmony Imaging software | Perkin Elmer | Ver 3.0.0 | |
| Columbus Image analysis software | Perkin Elmer | Ver 2.3.2 | |
| CyBi Hummingwell liquid handling | CyBio AG | OL 3387 3 0110 |
Referências
- Schulte, J., Sepp, K. J., Wu, C., Hong, P., Littleton, J. T. High-content chemical and rnai screens for suppressors of neurotoxicity in a huntington’s disease model. PLoS ONE. 6 (8), e23841 (2011).
- Honarnejad, K., et al. Development and implementation of a high-throughput compound screening assay for targeting disrupted ER calcium homeostasis in Alzheimer’s disease. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
- Burkhardt, M. F., et al. A cellular model for sporadic ALS using patient-derived induced pluripotent stem cells. Mol Cell Neurosci. 56, 355-364 (2013).
- Mattiazzi, U., et al. High-Content Screening for Quantitative Cell Biology. Trends Cell Biol. 26 (8), 598-611 (2016).
- Kato, S. Amyotrophic lateral sclerosis models and human neuropathology: Similarities and differences. Acta Neuropathologica. 115 (1), 97-114 (2008).
- Strong, M. J., Kesavapany, S., Pant, H. C. The pathobiology of amyotrophic lateral sclerosis: a proteinopathy?. J neuropathol exp neurol. 64 (8), 649-664 (2005).
- Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS. Nat rev Neurosci. 2 (11), 806-819 (2001).
- Bruijn, L. I., Miller, T. M., Cleveland, D. W. Unraveling the Mechanisms Involved in Motor Neuron Degeneration in Als. Annu Rev Neurosci. 27 (1), 723-749 (2004).
- Vassall, K. a., et al. Decreased stability and increased formation of soluble aggregates by immature superoxide dismutase do not account for disease severity in ALS. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (6), 2210-2215 (2011).
- Hwang, Y. M., et al. Nonamyloid aggregates arising from mature copper/zinc superoxide dismutases resemble those observed in amyotrophic lateral sclerosis. J Biol Chem. 285 (53), 41701-41711 (2010).
- Kim, J., et al. Dimerization, Oligomerization, and Aggregation of Human Amyotrophic Lateral Sclerosis Copper/Zinc Superoxide Dismutase 1 Protein Mutant Forms in Live Cells. J Biol Chem. 289 (21), 15094-15103 (2014).
- Shaw, B. F., et al. Detergent-insoluble aggregates associated with amyotrophic lateral sclerosis in transgenic mice contain primarily full-length, unmodified superoxide dismutase-1. J Biol Chem. 283 (13), 8340-8350 (2008).
- Banci, L., et al. SOD1 and amyotrophic lateral sclerosis: Mutations and oligomerization. PLoS ONE. 3 (2), 1-8 (2008).
- Johnston, J. a., Dalton, M. J., Gurney, M. E., Kopito, R. R. Formation of high molecular weight complexes of mutant Cu, Zn-superoxide dismutase in a mouse model for familial amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci. 97 (23), 12571-12576 (2000).
- Niwa, J. I., et al. Disulfide bond mediates aggregation, toxicity, and ubiquitylation of familial amyotrophic lateral sclerosis-linked mutant SOD1. J Biol Chem. 282 (38), 28087-28095 (2007).
- Juneja, T., et al. Prognosis in familial amyotrophic lateral sclerosis: progression and survival in patients with glu100gly and ala4val mutations in Cu,Zn superoxide dismutase. Neurology. 48 (1), 55-57 (1997).
- Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
- de Bruyns, A., Geiling, B., Dankort, D. Construction of Modular Lentiviral Vectors for Effective Gene Expression and Knockdown. Methods Mol Biol. 1448, 3-21 (2016).
- Sirven, A. Enhanced Transgene Expression in Cord Blood CD34+-Derived Hematopoietic Cells, Including Developing T Cells and NOD/SCID Mouse Repopulating Cells, Following Transduction with Modified TRIP Lentiviral Vectors. Mol Ther. 3 (4), 438-448 (2001).
- Wu, C., Lu, Y. High-titre retroviral vector system for efficient gene delivery into human and mouse cells of haematopoietic and lymphocytic lineages. J gen virol. 91 (Pt 8), 1909-1918 (2010).
- Irshad, H., Veillard, A., Roux, L., Racoceanu, D. Methods for nuclei detection, segmentation, and classification in digital histopathology: A review-current status and future potential. IEEE Rev Biomed Eng. 7, 97-114 (2014).
- Purschke, M., Rubio, N., Held, K. D., Redmond, R. W. Phototoxicity of Hoechst 33342 in time-lapse fluorescence microscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (12), 1634-1639 (2010).
- Jaskova, K., Pavlovicova, M., Jurkovicova, D. Calcium transporters and their role in the development of neuronal disease and neuronal damage. Gen physiol biophys. 31 (4), 375-382 (2012).
- Kieran, D., et al. Treatment with arimoclomol, a coinducer of heat shock proteins, delays disease progression in ALS mice. Nat Med. 10 (4), 402-405 (2004).
