Um protocolo simples para a superexpressão e purificação da cis -preniltransferase humana, otimizada com codão, em condições não desnaturantes, de Escherichia Coli , é descrito, juntamente com um ensaio de actividade enzimática. Este protocolo pode ser generalizado para a produção de outras proteínas de cis- preniltransferase em quantidade e qualidade adequadas para estudos mecanicistas.
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Artigo de método
Sobreexpressão e purificação do ser humano Cis -preniltransferase em Escherichia coli
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As preniltransferases (PT) são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia do difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação. DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica (formando cis duplas ligações da reação de condensação) que catalisa o alongamento da cadeia do difosfato de farnesilo (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP). DHDDS é de importância biomédica, como uma mutação não-conservadora (K42E) na enzima resulta em retinite pigmentosa , levando finalmente a cegueira. Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir grandes quantidades de DHDDS purificado, adequado para estudos mecanicistas. Aqui, o uso de fusão de proteínas, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humanos funcionalmente ativos em cis -PT entre diferentes espécies sugere que este protocolo pode ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também, como as envolvidas na síntese de borracha natural.
Introdução
As preniltransferases são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia de difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação 1 , 2 . As enzimas de tipo Z catalisam a formação de duplas ligações cis da reação de condensação, enquanto as enzimas do tipo E catalisam a formação de ligações duplas trans 3 . cis -Prenyltransferases (cis-PT, enzimas do tipo Z) são classicamente classificados de acordo com o comprimento da cadeia do produto para de cadeia curta (C 15), de cade....
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Protocolo
1. Clonagem de cis -PT para superexpressão em E. coli
- Se obter o vector de expressão pET-32b, concebidos para a clonagem e expressão de alto nível de sequências de proteínas fundidas com a proteína de 109aa tioredoxina (TRX) 17, e E. coli cod-optimizada 18 sequcia de comprimento completo -PT-cis codificação.
- Tome cuidado para ter um site de clivagem de TEV-protease (proteina de vírus de gravura de tabaco) (ENLYFQ / G, onde "/" indica o ponto de clivagem) 9 seguido de um ligador flexível curto (SGSGSG, para aumentar a acessibilidade do espaç....
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Resultados
A visão geral da construção usada aqui e o processo de purificação são mostrados na Figura 1 . As amostras obtidas em cada passo de purificação são mostradas na Figura 2 . Esta análise SDS-PAGE mostra a purificação gradual de DHDDS, resultando em um produto altamente purificado. A Figura 3 mostra os resultados da SEC analítica da enzima purificada, revelando que a proteína só é observada como um hom.......
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Discussão
O protocolo descrito aqui para a purificação de DHDDS humano funcional em células de E. coli é simples e eficiente, permitindo a sobreexpressão e purificação da proteína em 3 a 4 dias, uma vez que uma construção adequada esteja disponível. Tais protocolos para a purificação de proteínas são de especial importância, dado os avanços no seqüenciamento do genoma, que forneceu uma infinidade de informações sobre a genética de muitas doenças 18 , exigindo assim o desenvolvimento de métodos de .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Excelência em Pesquisa (I-CORE) da Fundação de Ciência da Ciência de Israel (1775/12) e a Fundação de Ciência de Israel concede 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). O apoio da Fields Estate Foundation à DK é altamente apreciado. Este trabalho foi realizado por Ilan Edri e Michal Goldenberg no cumprimento parcial dos requisitos de tese de MD da Faculdade de Medicina de Sackler, Universidade de Tel Aviv.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competente E. coli (Alta eficiência) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, Inibidor de Protease sem EDTA Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| resina TALON-superflow | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 coluna de dessalinização | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| aumento superdex-200 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenil pirofosfato | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesil pirofosfato | Sigma | 44270-10MG |
Referências
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., K....
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Reimpressões e permissões
