Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Summary

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Abstract

Moleküler genetik araştırmalar onun müthiş araçlar nedeniyle Arabidopsis thaliana bitki Biyoloji ve başta bitki üreme biyolojisi en önemli modeli türlerinden biridir. Ancak, bitki morfolojik, anatomik ve ultrastructural analizler geleneksel olarak zaman alıcı gömme ve yordamlar parlak alan, tarama ve elektron mikroskopi kesit olarak içerir. Confocal floresan mikroskopisi, state-of–art 3-b bilgisayar destekli Mikroskopik analizler ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılmak üzere moleküler teknikleri sürekli arıtma son ilerleme için artan bir talep yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri geliştirmek. Bu iletişim kuralı ‘ biz düzgün Arabidopsis çiçek ve siliques, temizleme teknikleri, temel anatomi tekniklerini tanımlamak ve bazı boyama işlemleri için bütün yapılar gözlemleri montaj.

Introduction

Çiçekler arasında en önemli organları kapalı tohumlular tanımlıyoruz. Çiçekli bitkiler ortaya çıktı bazı 90-130 milyon yıl önce¹ve çeşitlendirilmiş hızlı rapid görünüşleri Charles Darwin²tarafından bir “iğrenç gizem” nitelendirildi. Bitki araştırmacılar çıkarlarını çiçek geliştirme çeşitlidir. Bir bütün veya belirli anatomik, yapısal ve işlevsel özellikleri çiçekler^{3,4,5,6 evrimi çiçek evrimsel kökeni anlamayla ilgili biraz araştırma odaklı} . Çiçek formu ve yapısı, hem de onlara, güvenerek cinsel ve eşeysiz üremenin biçimi yüksek değişim son derece karmaşık bir yapı çiçek olun. Çiçek organlarını, genetik ve moleküler İncelemeler⁷ile kombine edilebilir ışık ve elektron microscopical teknikleri kullanarak anatomi ve yapısal özelliklerini tanımlamak için çeşitli çabalar yol açmıştır. Ayrıca, kaynak, meyve ve tohum, çiçek büyük önem insan ve hayvan beslenmesi için vardır. Bu nedenle, çiçek ve meyve geliştirme karakterizasyonu uygulamalı araştırma, gıda güvenliği için bir artan insan nüfusu ve ekolojik koruma stratejileri değişen çevre⁸ altında da dahil olmak üzere birçok etkileri vardır ^{, 9 , 10}.

Arabidopsis geliştirmede çiçek çiçek indüksiyon ve önümüzdeki (çiçek grubu) meristem için bitkisel meristem dönüşüm başlar. Çiçek primordia yanal önümüzdeki meristem¹¹Açıl başlatılır. Çiçek organ primordia giderek çiçek ortasına dışarıdan konsantrik gözlemleyebileceğiniz form ve sonunda sepals, yaprakları, stamens ve carpels⁷geliştirmek. Çiçek Bu organların farklı besin, koruyucu ve fonksiyonel (örneğin, tozlayıcı cazibe) yerine farklı bitki türü, erkek ve dişi gametophytes, sırasıyla¹² gelişimi sürdürülmesi cinsel organları ile rolleri ^{, 13}. gametophytes, buna karşılık, her bir çift erkek (sperm) ayırt etmek ve kadın gametler (yumurta ve merkezi hücre), üzerine birleştirmek çift döllenme nesil, zigot ve birincil endosperm oluşturmak için bir terminal doku destekleyen embriyo^14,15geliştirilmesi. Meyve ve tohum geliştirme desteği büyüme, olgunlaşma ve embriyo ve sonunda, onun dağılma korunması. Kapsamlı bir araştırma modeli tür Arabidopsis^7,16,17, özellikle farklı bitki türleri çiçek ve embriyo geliştirilmesinde karakterize etmek için yapıldı.

Çiçek gelişiminin erken Mikroskopik analizler zaman alıcı örnek işleme ve gözlem teknikleri, parafin veya reçine katıştırma ve kesit, gibi ışık ya da elektron mikroskobu ile birlikte dayalı idi. Bu geleneksel mikroskobik teknikler kez mutantlar, RNA Yerelleştirme in situ hibridizasyon tarafından veya IMMUNO-algılama proteinlerin microscopical analizleri gibi moleküler genetik araştırmalar ile birlikte kullanılmaya başlanmıştır. State-of–art 3 boyutlu bilgisayar destekli görüntü analizleri ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılabilir moleküler yöntemler sürekli arıtma geniş alanlı ve confocal floresan mikroskopi son ilerleme için bir ihtiyaç yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri kantitatif analizleri için tercihen mükellef bulunmaktadır. Son yıllarda, önemli bütün Dağı hayvan numune Temizleme teknikleri geliştirme konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Onlar render örnek şeffaf Sulu üre veya şeker tabanlı reaktifler (örneğin, ölçek, SeeDB, kübik) kullanarak^18,19,20, veya seçici (SDS deterjan kullanarak) lipidler sonra kaldırarak örnekleri istikrarlı hydrogels katıştırma; lipidler kaldırılması olabilir pasif Difüzyon tarafından elde (örneğin, değiştirilmiş NETLİK protokolü²¹, PAKTI-PARS-jantlar²²) veya aktif Elektroforez (orijinal NETLİK protokolü²³ ve hareket-PRESTO²⁴). Bu hızlı ilerleme tarafından teşvik, türetilmiş bazı teknikler de bitkiler kullanmak için ortaya çıkıyor.

Bu yöntemleri kağıt model Arabidopsisüzerinde duruldu, biz için prosedür çiçek tomurcukları, çiçek ve genç siliques uygun diseksiyon ve tüm montaj örnekleri çeşitli boyama için takas ve gözlem yordamları kullanarak tarif Klasik veya son SDS-esaslı temizleme yöntemi. Nişasta, callose ve Kromatin boyama örnekleri verilmiştir. Her ne kadar bu yordamları daha fazla geliştirmeleri ve diğer türler ile kullanıldığında uyarlamalar ihtiyacınız, onlar için daha fazla araştırma birçok araştırma projelerinin başlangıç noktası olan bu basit ama kritik yöntemlere sahne umuyoruz.

Protocol

1. çiçek ve Silique fiksasyon Hasat çiçekler ve bitkiler siliques ilk çiçek açılışında senkronize.Not: Burada kullanılan deneysel koşullar altında yaklaşık 21 gün sonra Murashige ve Skoog (MS) plakalar üzerinden ekimi için toprak çiçekli bitkiler başlatın. Tohumları 4 ° C’de 3-4 gündür tabakalı ve germinated/MS plakaları 22 ° C/16 h ışık ve 18 ° C/8 h karanlık 8-10 gün önce besin açısından zengin toprak (şekil 1) aynı koşullarda muhafa…

Representative Results

Arabidopsis bir corymb (şekil 1) biseksüel tanzimi ile çiçek taşıyan Brassicacea ailesine ait. Her çiçek dört sepals, dört yaprakları, altı stamens (dört uzun lafın kısası iki) ve dört konsantrik gözlemleyebileceğiniz25,26yılında düzenlenmiş iki doğuştan erimiş carpels (şekil 1F-H) oluşan bir syncarpous gynoecium var. …

Discussion

Birçok çiçek tomurcukları Arabidopsistüm çiçek gelişim aşamalarında, kapsayan, tek bir önümüzdeki içinde varlığını bir tedavi ya da bir gelişimsel özelliği bir etkisi karakterize yönelik çalışmalar için eşsiz bir fırsat sunuyor aynı anda farklı gelişimin çiçek arasında. Farklı bireysel bitkiler arasında iyi bir referans noktası ana önümüzdeki ilk çiçek açıyor. Bitkiler çiçekli eşitlenir şekilde tedavi edilir (örneğin, 3-4 gün stratifikasyon 4 ° C’de en…

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.