Hele-mount Clearing og flekker av Arabidopsis blomst organer og Siliques

Summary

Denne protokollen, vi beskriver teknikker for riktig dissection Arabidopsis blomster og siliques, noen grunnleggende clearing teknikker, og valgt flekker prosedyrer for hele-mount observasjoner av reproduktive strukturer.

Abstract

På grunn av sin formidable verktøy for molekylær genetisk studier er Arabidopsis thaliana en av de mest fremtredende modell artene i anlegget biologi og særlig i anlegget Reproduktivt biologi. Men innebære plante morfologiske, anatomiske og ultrastructural analyser tradisjonelt tidkrevende innebygging og snitting prosedyrer for lyse feltet, skanning og elektronmikroskop. Framskritt i AC confocal fluorescens mikroskopi, state-of-the-art 3D dataassistert mikroskopiske analyser og kontinuerlig avgrensningen av molekylære teknikker brukes på minimalt prosesserte hele-mount prøver, har ført til økt etterspørsel etter utvikle effektiv og minimal prosessering teknikker. I denne protokollen, vi beskriver teknikker for riktig dissekere Arabidopsis blomster og siliques, grunnleggende clearing teknikker, og noen flekker prosedyrer for hele-mount observasjoner av reproduktive strukturer.

Introduction

Blomster er blant de viktigste definere organer av Dekkfrøede planter. Blomsterplanter dukket opp noen 90 – 130 millioner år siden¹, og diversifisert så fort at utseendet rask ble beskrevet som en “avskyelige mystery” av Charles Darwin². Interessene til anlegget forskere i utvikling blomst er mangfoldig. Noen undersøkelser har fokusert på å forstå evolusjonære opprinnelsen til blomsten som en helhet, eller utviklingen av bestemte anatomiske, strukturelle og funksjonelle egenskaper blomster^3,4,5,6 . Høy variasjonen i floral form og struktur, samt moduser av seksuelle og aseksuell reproduksjon stole på dem, gjør blomsten en svært komplisert struktur. Dette har ført til variert innsats for å karakterisere funksjonene anatomi og strukturelle floral organer, med lys og elektron microscopical teknikker som kan kombineres med genetisk og molekylære undersøkelser⁷. Videre som kilde av frukt og frø, er blomster av avgjørende betydning for mennesker og dyr ernæring. Derfor har karakterisering av blomst og frukt utvikling mange implikasjoner for anvendt forskning, inkludert matsikkerhet for et stadig økende befolkningen og økologiske bevaringsstrategiene under skiftende miljø^{8 , 9 , 10}.

Flower utvikling i Arabidopsis starter med blomst induksjon og transformasjonen av den vegetative meristem til en sitter (gruppe blomster)-meristem. Blomst primordia er initiert sidelengs på flanken av de sitter meristem¹¹. De floral orgel primordia form gradvis i konsentriske kranser utenfra til midten av blomsten, og til slutt utvikle seg til kronblader, kronblad, pollenbærere og carpels⁷. Disse floral organer oppfylle forskjellige nutritive, beskyttende, og funksjonell (f.ekspollinator attraksjon) roller i forskjellige plantearter, med kjønnsorganene opprettholde utviklingen av mannlige og kvinnelige gametophytes, henholdsvis^{12 , 13}. gametophytes, i sin tur hver skille et par mann (sperm) og kvinnelige gameter (egg og sentrale celle), som knytter på dobbel-fertilisering til neste generasjon, zygoten og den primære endosperm, en terminal vev støtte den utvikling av embryoet^14,15. Frukt og frø støtte vekst, modning, og bevaring av embryoet og senere sin spredning. Omfattende forskning har utført betegner blomst og embryo utvikling i forskjellige plantearter, spesielt i modellen arten Arabidopsis^7,16,17.

Tidlig mikroskopiske analyser av flower utvikling var basert på tidkrevende prøve behandling og observasjon teknikker, slik som parafin eller harpiks innebygging og snitting kombinert med lys eller elektronmikroskop. Disse tradisjonelle mikroskopiske teknikker ble ofte brukt i kombinasjon med molekylær genetisk undersøkelser, som microscopical analyser av mutanter, lokalisering av RNA av i situ hybridisering eller immuno-påvisning av proteiner. Framskritt i fluorescens wide-feltet og AC confocal mikroskopi, state-of-the-art 3D dataassistert bilde analyser og kontinuerlig avgrensningen av molekylære metoder som kan brukes på minimalt prosesserte hele-mount prøver, har ført til et behov for effektiv og minimal prosessering teknikker som er fortrinnsvis mottakelig for kvantitative analyser. De siste årene, har betydelig fremgang gjort utvikle clearing teknikker på hele-mount dyr prøven. De gjengi prøven gjennomsiktig ved å bruke kammervann urea – eller sukker-basert reagenser (f.eksskala, SeeDB, CUBIC)^18,19,20, eller selektivt fjerne lipider (med vaskemiddel SDS) etter innebygging prøver i stabile hydrogels; fjerning av lipider kan oppnås ved passiv diffusjon (f.eksendret KLARHET protokollen²¹, pakt-PARS-FELGER²²) eller aktivt geleelektroforese (opprinnelige KLARHET protokollen²³ og ACT-PRESTO²⁴). Oppmuntret av denne framskritt, noen avledede teknikker er også nye for bruk i planter.

I notatet metoder fokusert på modellen Arabidopsis, beskriver vi fremgangsmåten for den riktige Disseksjon av blomsten knopper, blomster, og unge siliques og clearing av hele-mount prøver for ulike flekker og observasjon prosedyrer som bruker klassisk eller siste SDS-baserte clearing metode. Eksempler for stivelse, callose og chromatin flekker er gitt. Selv om disse prosedyrene kan trenge ytterligere forbedringer og tilpasninger når den brukes med andre arter, håper vi de vil sette scenen for videre forskning på disse enkle, men avgjørende metoder som er utgangspunktet for mange forskningsprosjekter.

Protocol

1. blomst og Silique fiksering Høst-blomster og siliques fra planter synkronisert ved åpningen av den første blomsten.Merk: Under eksperimentelle forhold her, planter begynne blomstring ca 21 dager etter transplantasjon fra Murashige og Skoog (MS) jord. Frø er lagdelt for 3-4 dager 4 ° C og spirer/dyrket på MS plater på 22 ° C/16 h lys og 18 ° C/8 h mørke for 8-10 dager, før transplanting seedlings på næringsrike jord i potter holdt under samme vilkår (figur 1). A…

Representative Results

Arabidopsis tilhører Brassicacea familie, bærer inflorescences med bifil blomster arrangert i en corymb (figur 1). Hver blomst har fire kronblader, fire petals, seks pollenbærere (fire lange og to korte) og en syncarpous gynoecium som består av to congenitally smeltet carpels (figur 1F-H) ordnet i fire konsentriske kranser25,26. Arabidops…

Discussion

Eksistensen av mange blomsterknopper innenfor en enkelt sitter i Arabidopsis, som strekker seg over alle blomst utviklingsstadier, tilbyr en unik mulighet for studier karakterisere en effekt av en behandling eller en utviklingsmessige funksjon samtidig over de ulike stadiene av utvikling blomst. Et godt referansepunkt mellom ulike personlige planter er åpningen av den første blomsten av de viktigste sitter. Planter er behandlet slik at blomstrende er synkronisert som mulig (f.eks3-4 dager lagdeling p?…

Materials

Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.