Haut débit séquençage parallèle à la mesure de remise en forme de Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants durant Golden syrien Hamster Infection
Summary
Nous décrivons ici une technique qui associe une mutagenèse par transposon séquençage haut-débit pour identifier et quantifier des mutants de leptospires transposon dans les tissus après une contestation des hamsters. Ce protocole peut être utilisé à des mutants de l’écran de survie et de la diffusion chez les animaux et peut également être appliqué à des études in vitro .
Abstract
Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un transposon séquençage (Tn-Seq) technique pour identifier et quantifier des mutants de Leptospira interrogans altérés de remise en forme au cours de l’infection de hamsters syriens dorés. TN-Seq combine la mutagénèse aléatoire transposon avec la puissance de la technologie de séquençage haut-débit. Animaux est mis au défi avec une piscine de mutants transposon (entrée piscine), suivie de la récolte du sang et des tissus quelques jours plus tard afin d’identifier et de quantifier le nombre de mutants dans chaque organe (sortie piscines). Les piscines de sortie sont comparés à la piscine d’entrée afin d’évaluer l’aptitude en vivo de chaque mutant. Cette approche permet le dépistage d’une grande piscine de mutants dans un nombre limité d’animaux. Avec des modifications mineures, ce protocole peut être effectué avec n’importe quel modèle animal de la leptospirose, modèles hôte réservoir comme les rats et les infections aiguës comme les hamsters, ainsi que des études in vitro . TN-Seq fournit un outil puissant à l’écran pour des mutants présentant des défauts de remise en forme in vivo et in vitro .
Introduction
Identification des gènes de virulence pour certaines bactéries, comme Leptospira spp., est difficile en raison du nombre limité d’outils génétiques disponibles. Une approche couramment utilisée est la création d’une collection de mutants par mutagenèse aléatoire transposon, suivie de l’identification du site d’insertion dans chaque mutant et test de virulence des mutants de transposon individuels dans un modèle animal. Cette approche est longue et coûteuse et nécessite un grand nombre d’animaux.
Lorsque la mutagénèse aléatoire a été d’abord développé pour le pathogène Leptospira interrogans, gènes impliqués dans la virulence ont été identifiés en testant différents mutants dans un modèle animal1. Mutants ont été sélectionnés selon des critères comme leurs rôles potentiels dans la signalisation ou la motilité ou leur prédit la membrane externe ou surface emplacement. Comme la majorité des leptospires gènes codent pour des protéines hypothétiques de fonction inconnue2, sélection des mutants basé sur ces limites de critères la capacité à découvrir des gènes de virulence de leptospires roman.
Plus récemment, piscines de mutants de transposon L. interrogans ont été examinés pour l’agent infectieux dans les modèles3hamster et souris. Chaque animal a été contestée avec une piscine de 10 mutants. Infectiosité d’un mutant a été marquée comme étant positif s’il a été détecté par PCR des cultures obtenues à partir de sang et les reins. Test de PCR a été laborieux car il exigeait une réaction de PCR individuelle pour chaque mutant dans la piscine. Parce que la fréquence de chaque mutant dans les cultures n’avait pas été évaluée, l’approche était biaisée vers l’identification des mutants très atténués.
Nous décrivons un transposon séquençage (Tn-Seq) technique, comme une stratégie pour dépister plus efficacement les gènes de virulence. TN-seq consistant en la création d’une bibliothèque de mutants par mutagénèse du transposon suivie par séquençage parallèle massive4,5,6. Brièvement, transposon mutants sont mis en commun, inoculés dans animaux et par la suite récupérés de différents organes (sortie piscines). L’ADN de la piscine de sortie est extraite et digéré par les enzymes de restriction ou cisaillée par sonication. Deux cycles de PCR ciblant les jonctions des sites d’insertion de transposon sont effectuées. Cette étape permet l’ajout de l’adaptateur nécessaire pour le séquençage. Les produits PCR obtenus sont analysés par séquençage haut-débit pour identifier le site d’insertion de transposon de chaque mutant de la piscine ainsi que de leur abondance relative, qui est comparé à la composition initiale du bassin de mutant.
Le principal avantage de cette approche est la capacité à l’écran simultanément un grand nombre de mutants avec un petit nombre d’animaux. TN-Seq n’exige pas la connaissance préalable des sites d’insertion de transposon qui augmente les chances de découvrir des nouveaux Leptospira-certains gènes impliqués dans la virulence avec moins de temps et une plus grande efficacité. Parce que le fardeau de leptospires dans les tissus est relativement élevée en rongeur modèles susceptibles d’être mortelles infections (typiquement 104 à 108 bactéries/g de tissu)7,8,9 , ainsi que dans des hôtes réservoirs 10,11, les tissus peuvent être analysés directement sans avoir à la culture, réduire les biais en raison de la croissance in vitro .
Dans les études de Tn-Seq avec la plupart des bactéries pathogènes décrites à ce jour, la haute fréquence de mutagenèse insertionnelle permis infection avec grandes piscines contenant des mutants ayant collectivement plusieurs insertions transposon rapprochés au sein de chaque gène4 ,12,13,14. TN-Seq a également été développé pour une bactérie dont la fréquence de la mutagénèse est beaucoup inférieur6. Avec Leptospira, une bibliothèque de mutants de transposons peut être générée en introduisant le transposon sur un plasmide mobilisable par conjugaison tel que décrit par Slamti et al.15. Toutefois, la fréquence de la mutagénèse transposon de L. interrogans est faible. Lorsque le transposon Himar1 a été introduit dans un plasmide conjugatif, la fréquence de transconjuguant a été signalée comme seuls 8,5 x 10-8 par destinataire de cellules souche de L. interrogans16 Lai et est susceptible d’être de même pauvre avec la plupart des autres souches de L. interrogans. Le protocole décrit ici est en partie basé sur conçu pour Borrelia burgdorferi, dont la fréquence de la mutagénèse insertionnelle transposon est également faible6.
Pour notre expérience pilote avec le protocole17, nous avons mené mutagénèse du transposon avec L. interrogans serovar Manilae souche L495 en raison du succès des autres groupes à isoler des mutants d’insertion de transposon dans la souche ainsi que sa faible DL50 (dose létale) pour virulence1. Nous avons projeté 42 mutants par Tn-Seq et identifié plusieurs candidats mutants défectueux dans la virulence, dont deux avec insertions dans un gène de l’adénylate cyclase du candidat. Une évaluation individuelle des deux mutants chez les hamsters ont confirmé qu’ils étaient déficients en virulence17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que les résultats de notre expérience pilote pour hamster contestée par voie intrapéritonéale avec 42 L. interrogans mutants sont présentés17, gageons que plus grandes piscines de mutants peuvent être projetés par Tn-suiv. Parce que la fréquence des transconjugants est faible (100-200 transconjugants/accouplement), plusieurs accouplements sont nécessaires pour générer un nombre suffisant de mutants pour les grandes expériences de Tn-Seq. Maintenir un grand nombre de mut…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par un prix de mérite d’affaires des anciens combattants (à D.A.H.) et un Institut National de la santé accorde le R01 AI 034431 (à D.A.H.).
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
Referências
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