Høy gjennomstrømming parallelle sekvensering å måle Fitness Leptospira interrogans Transposon innsetting mutanter under Golden Syrian Hamster infeksjon
Summary
Her beskriver vi en teknikk som kombinerer transposon mutagenese med høy gjennomstrømming sekvensering å identifisere og telle transposon leptospiral mutanter i vev etter en utfordring hamstere. Denne protokollen kan brukes til skjermen mutanter for overlevelse og spredning i dyr og kan også bli brukt i vitro studier.
Abstract
I dette manuskriptet beskriver vi en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknikk for å identifisere og telle Leptospira interrogans mutanter endret i fitness under infeksjon av Golden syrer hamsters. TN-Seq kombinerer tilfeldig transposon mutagenese med kraften av høy gjennomstrømming sekvensering teknologi. Dyr blir utfordret med en pool av transposon mutanter (input pool), etterfulgt av høsting av blod og vev noen dager senere for å identifisere og telle antall mutanter i hvert organ (output bassenger). Utgang bassengene er sammenlignet med inndata bassenget evaluere i vivo egnethet av hver mutant. Denne tilnærmingen gjør screening av en stor pool av mutanter i et begrenset antall dyr. Med mindre modifikasjoner, kan denne protokollen utføres med noen dyr modell for leptospirose, reservoaret vert modeller som rotter og akutt infeksjon modeller som hamsters, samt i vitro studier. TN-Seq gir et kraftig verktøy til skjermen for mutanter med i vivo og i vitro fitness defekter.
Introduction
Identifikasjon av virulens gener for noen bakterier, som Leptospira spp., er vanskelig på grunn av begrenset antall genetisk verktøy tilgjengelig. En brukte tilnærming er etableringen av en samling av mutanter av tilfeldige transposon mutagenese etterfulgt av identifisering av innsetting site i hver mutant og virulens testing av personlige transposon mutanter i en dyremodell. Denne metoden er tidkrevende, dyre, og krever et stort antall dyr.
Når tilfeldig mutagenese ble først utviklet for patogen Leptospira interrogans, ble gener involvert i virulens identifisert ved å teste individuelle mutanter i en dyremodell1. Mutanter ble valgt basert på kriterier som deres potensielle roller i signalering eller motilitet eller deres spådd ytre membran eller overflate plassering. Som fleste leptospiral gener kode hypotetisk proteiner av ukjent funksjon2, velge mutanter basert på disse vilkår begrenser muligheten til å oppdage romanen leptospiral virulens gener.
Flere nylig, av L. interrogans transposon mutanter ble vist for infectivity i hamster og musen modeller3. Hvert dyr ble utfordret med basseng av opp til 10 mutanter. Infectivity av en mutant ble scoret som positive hvis det ble oppdaget av PCR kulturer blod og nyre. PCR testing var arbeidskrevende fordi det kreves en personlige PCR-reaksjon for hver mutant i bassenget. Fordi frekvensen av hver mutant i kulturer ikke var kvantifisert, var tilnærming forutinntatt mot identifikasjon av svært dempes mutanter.
Vi beskriver en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknikk, som en strategi for å mer effektivt skjermen for virulens gener. TN-seq består av etableringen av et bibliotek av mutanter av transposon mutagenese etterfulgt av massiv parallelle sekvenser4,5,6. Kort, transposon mutanter er samlet inokulert til dyr og senere utvinnes fra ulike organer (output bassenger). DNA fra utdataene bassengene er trukket ut og fordøyd med begrensning enzymer eller skåret av sonication. To rundene PCR målretting knutepunktene i webområdene transposon innsetting utføres. Dette trinnet gjør tillegg av adaptere nødvendig for sekvensering. De resulterende PCR-produktene analyseres av høy gjennomstrømming sekvensering å identifisere webområdet transposon innsetting av hver mutant av basseng samt deres relative overflod, som er i forhold til første sammensetningen av bassenget til mutant.
Den primære fordelen med denne tilnærmingen er muligheten til å samtidig skjermen et stort antall mutanter med et lite antall dyr. TN-Seq ikke krever forutgående kunnskap om transposon innsetting nettsteder som øker sjansene for å oppdage nye Leptospira-bestemte gener involvert i virulens med mindre tid og større effektivitet. Fordi leptospiral byrden i vev er relativt høy i gnager modeller utsatt for dødelige infeksjoner (vanligvis 104 til 108 bakterier/g av vev)7,8,9 så vel som i reservoaret verter 10,11, vev kan analyseres direkte uten å måtte kultur, redusere fordommer på grunn av veksten i vitro .
Tn-Seq studier med de fleste bakterielle patogener beskrevet hittil, den høye frekvensen av insertional mutagenese tillatt infeksjon med store bassenger med mutanter kollektivt har flere kryr transposon innsettinger i hver genet4 ,12,13,14. TN-Seq har også blitt utviklet for en bakterie som mutagenese frekvensen er mye lavere6. Med Leptospira, kan et bibliotek med transposon mutanter genereres ved å innføre transposon på en mobilizable plasmider av Bøyning som beskrevet av Slamti et al15. Men er frekvensen av transposon mutagenese av L. interrogans lav. Da Himar1 transposon ble innført på en konjugerbart plasmider, ble transconjugant frekvensen rapportert å være bare 8,5 x 10-8 per mottaker cellen med Lai belastningen av L. interrogans16 og trolig bli tilsvarende dårlig med de fleste andre stammer av L. interrogans. Protokollen beskrevet her er delvis basert på som utviklet for Borrelia burgdorferi, der frekvensen av transposon insertional mutagenese er også lav6.
For våre pilotprosjekt med protokollen17gjennomførte vi transposon mutagenese med L. interrogans serovar Manilae belastning L495 på grunn av andre grupper i isolere transposon innsetting mutanter i belastningen med sin lave LD50 (dødelig dose) for virulens1. Vi vist 42 mutanter av Tn-Seq og identifisert flere mutant kandidater defekt i virulente, inkludert to med innsettinger i en kandidat adenylate cyclase genet. Personlige testing av to mutanter i hamstere bekreftet at de var mangelfull i virulens17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om resultatene fra våre pilotprosjekt for hamster utfordret intraperitoneally med 42 L. interrogans mutanter presenteres17, forventer vi at større bassenger av mutanter kan bli vist av Tn-Seq. Fordi frekvensen av transconjugants er lav (100-200 transconjugants/parring), flere parring er nødvendig for å generere et tilstrekkelig antall mutanter for store Tn-Seq eksperimenter. Opprettholde et stort antall mutanter i flytende kulturer presenterer logistiske utfordringer som må løs…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en Veterans Affairs Merit Award (til D.A.H.), og en National Institute of Health gi R01 AI 034431 (til D.A.H.).
Materials
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
Referências
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
- Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
- Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
- Wunder, E. A., et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
- Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
- Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
- Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
- Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
- Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
- Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
- Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
- Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
- Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
- Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- Miller, J. . Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
- Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
- Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
- McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
- Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
- Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
- Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
- Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).
