Une méthode pratique pour l’Extraction et analyse par chromatographie liquide à haute pression des neurotransmetteurs catécholamines et de leurs métabolites
Summary
Nous présentons une commode extraction en phase solide couplée à la chromatographie liquide à haute pression (CLHP) avec détection électrochimique (DCE) pour la détermination simultanée de trois neurotransmetteurs de monoamine et deux de leurs métabolites dans les urines des enfants en bas âge. Nous identifions également le métabolite MHPG comme un biomarqueur potentiel pour le diagnostic précoce des lésions cérébrales chez les nourrissons.
Abstract
L’extraction et l’analyse des neurotransmetteurs catécholamines dans les liquides biologiques est d’une grande importance pour évaluer le fonctionnement du système nerveux et les maladies apparentées, mais leur mesure précise est toujours un défi. De nombreux protocoles ont été décrites pour la mesure de la neurotransmetteur par une variété d’instruments, y compris la chromatographie liquide à haute pression (HPLC). Cependant, il existe des lacunes, comme l’opération compliquée ou difficile à détecter des cibles multiples, qui ne peuvent être évités, et actuellement, la technique d’analyse dominant est toujours HPLC couplé avec électrochimiques sensibles ou détection fluorimétrique, due à sa sensibilité élevée et bonne sélectivité. Ici, un protocole détaillé est décrit pour le prétraitement et la détection des catécholamines par chromatographie liquide à haute pression avec détection électrochimique (HPLC-DPE) dans les échantillons d’urine réelle des nourrissons, à l’aide de nanofibres composite électrofilées composé des polymères éther couronne avec du polystyrène comme adsorbant, également connu comme la méthode d’extraction (PFSPE) emballé-fibre en phase solide. Nous montrons comment urine échantillons peuvent être facilement precleaned par une colonne de nanofibres-emballés en phase solide, et comment l’analyser dans l’échantillon peut être rapidement enrichi, désorbés et détecté sur un système de développement du jeune enfant. PFSPE simplifie considérablement les procédures de prétraitement des échantillons biologiques, permettant une diminution de temps, frais et réduction de la perte de cibles.
Dans l’ensemble, cet ouvrage illustre un protocole simple et commode pour l’extraction en phase solide couplée à un système HPLC-DCE pour la détermination simultanée de trois neurotransmetteurs monoamines (noradrénaline (Na), épinéphrine (E), dopamine (DA)) et deux de leurs métabolites (3-méthoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) et l’acide 3, 4-dihydroxy-phénylacétique (DOPAC)) dans les urines des enfants en bas âge. Le protocole établi a été appliqué pour évaluer les différences des catécholamines urinaires et leurs métabolites entre les nourrissons à haut risque avec des lésions cérébrales périnatales et témoins sains. Analyse comparative révèle une différence significative dans le MHPG urinaire entre les deux groupes, ce qui indique que les métabolites des catécholamines peuvent être un marqueur important de candidats pour un diagnostic précoce des cas à risque de lésions cérébrales chez le nourrisson.
Introduction
Neurotransmetteurs catécholamines et leur contenu de métabolites dans les fluides corporels peut affecter la fonction neurale et affecter l’équilibre des États aux stimuli-réponse à une grande partie1. Anormales peut causer une variété de maladies, telles que pheochromacytoma, SURRENALIEN, neuroblastome et troubles neurologiques1,2. L’extraction et le dosage des catécholamines dans les fluides corporels est significatif pour le diagnostic des maladies concernées. Cependant, les catécholamines dans des échantillons biologiques existent en faibles concentrations et sont facilement oxydés. En outre, ils sont très difficiles à éluer à cause de la grande quantité d’interférence en moyenne3. Ainsi, la détection simultanée des catécholamines dans les liquides biologiques est toujours un défi.
Il y a eu des commentaires montrant que les catécholamines urinaires peuvent être une mesure de contrainte, et que leurs niveaux sont des marqueurs biologiques importantes répondant à la stimulation tactile, traitement des nouveaux-nés5. Selon les recherches, tous les nourrissons qui ont subi des incidents prématurées sont à risque de blessures de cerveau pour4,5,6, et blessure peut provoquer la libération anormale des catécholamines et des questions connexes dans les fluides. Il existe des techniques avancées de résonance magnétique capable de détecter des lésions cérébrales dans les précédentes phases7,8. Toutefois, dans les premières 48 h, un processus de développement neurologique anormal provoque crânien permanent qui ne sera pas évident dans des images médicales11. En outre, les ressources de l’instrument haut coût et rares, ainsi que d’autres facteurs, le rend impossible pour toutes les unités néonatales d’avoir accès à ces techniques spécialisées de neuro-imagerie. Cependant, l’utilisation d’un biomarqueur facilement accessible et pratique (tels que les catécholamines et leurs métabolites) pourrait surmonter ces lacunes, et la projection d’un biomarqueur dans les fluides humains peut aider dans le diagnostic précoce des lésions cérébrales et prendre rapidement des identification des nouveau-nés qui ont besoin de neuroprotection9. Les catécholamines dans l’urine peuvent être un indice simple et évident, en raison de la corrélation directe entre le montant de leur libération dans les fluides et la fonction neuroactivity.
Parmi les liquides biologiques, le liquide céphalorachidien (LCR) et des échantillons de plasma ne sont pas faciles à obtenir par l’intermédiaire de procédures traumatisantes existantes, et il est aussi très difficile de se débarrasser des perturbations dues à la protéine adhésive et d’autres impuretés, conduisant à une pénible et processus fastidieux d’échantillonnage qui ne convient pas pour la détection répétée. Aussi, pour les enfants, il est presque impossible d’obtenir les échantillons de façon traumatique. Prélèvement urinaire est donc mieux que les autres formes d’échantillonnage, car il est non invasif, facile à utiliser et peut être fait à plusieurs reprises. Les échantillons d’urine sont abondants et faciles à stocker et montrent de grands avantages sur les autres formes d’échantillons biologiques.
Les principales méthodes pour quantifier des catécholamines dans les liquides biologiques comprennent les radioenzymic dosages10dosages immunitaire-sorbent-enzymatique11, voltamétrie12 et lentille thermique spectrométrie13. Mais lacunes existent, telles que des opérations complexes et difficiles à détecter des cibles multiples. Aujourd’hui, la technique d’analyse dominante est de chromatographie liquide à haute performance (HPLC)14, couplé avec sensible électrochimique15 ou fluorimétrique détection16, en raison de sa grande sensibilité et une bonne sélectivité. Avec la technologie de spectrométrie de masse en tandem, comme la chromatographie en phase liquide/spectrométrie de masse (LC/MS) et liquid chromatography/mass spectrometry/spectrométrie de masse (LC/MS/MS), l’analyse et la quantification des neurotransmetteurs peuvent atteindre de haut précision et la spécificité de17,18. Cependant, la technique MS nécessite instrumentation coûteuse comme main-d’œuvre largement qualifiée, rendant la méthode difficilement applicable universellement dans les laboratoires plus classiques. Systèmes HPLC-DCE sont équipés généralement dans les laboratoires cliniques et plus classiques et sont ainsi devenus un choix commun et bon pour les groupes de recherche à utiliser pour le dosage chimique, mais elles nécessitent l’échantillon introduit dans le système pour être propre et de a petite Echelle volume19. Ainsi, il est d’une grande importance pour purifier et condenser l’échantillon avant l’analyse. La méthode classique pour la purification est extraction liquide-liquide14,15,20 et off-line extraction en phase solide, y compris l’alumine activée colonne21,22 et diphenylborate (DPBA) complexation23,24,25,26.
Myeongho Lee et al. ont utilisé résine polymère modifié chimiquement avec de l’éther couronne comme l’adsorbant pour extraire sélectivement des catécholamines dans l’urine humaine depuis 200727. En outre, en 2006, Haibo He et al. fait preuve d’une approche de synthèse facile pour boronates affinité extraction sorbant byutilizing un nanomagnétiques fonctionnalisable polyédriques SILSESQUIOXANES oligomériques (POSS) selon des structures composite et appliquant à l’enrichissement des catécholamines dans l’urine humaine (noradrénaline, adrénaline et à l’isoprénaline)28. Ils ont également profité de la nanomatériaux pour accomplir le travail, en utilisant une technologie appelée nano-électrofilage et formant le matériau fibreux de polymère à l’échelle nanométrique. Le processus électrofilage peut ajuster le diamètre, la morphologie et alignement spatiale du produit en contrôlant la tension de service et de modifier le contenu de la solution de filage ainsi que d’autres paramètres29. Comparée à la cartouche SPE classique, nanofibres électrofilées sont très adaptés extraire et enrichir les analytes cibles d’une matrice complexe, car elles sont équipées des rapports élevés de surface-surface-à-volume d’adsorber les analytes à haut rendement, et pièce plus facilement contrôlée par surfaces propriétés chimiques, permettant la fixation pratique des composés cibles. Ces propriétés font le bon choix pour adsorbants SPE, qui réduit considérablement la phase solide et la désorption solvant montant30,31,32,33. Des catécholamines dans les échantillons d’urine, nanofibres électrofilées composés d’éther couronne apolymeric avec du polystyrène (PCE-PS) ont été utilisés pour extraire sélectivement trois catécholamines (NE, E et DA)34. Le document indiquait que l’éther couronne sélective adsorbés les cibles du NE, E et DA, qui reposait sur sa géométrie correcte permettant de lier les catécholamines via formant des liaisons hydrogènes. Les résultats affichés l’éther couronne matérielle efficacement, éliminer les autres composés interférents contenues dans des échantillons biologiques. Inspiré par ce rapport, une nouvelle méthode a été développée pour l’extraction sélective des catécholamines par utilisation de nanofibres composite électrofilées composé de PCE-PS.
Dans cet article, la méthode déjà rapporté34 a été améliorée et utilisée non seulement pour analyser avec succès E, NE et DA, mais aussi leurs métabolites, MHPG et DOPAC, dans l’urine. Nous explorons également de nouvelles possibilités pour le mécanisme du processus d’adsorption. La méthode montre satisfaisant de l’efficacité d’extraction et de sélectivité pour les cinq analytes, et la méthode a été vérifiée dans l’analyse de l’urine de nouveau-nés à haut risque avec des lésions cérébrales périnatales et témoins sains.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode PFSPE proposée dans le présent document peut être importante et significative en ce qui concerne sa rapidité, simplicité et commodité. Les adsorbants utilisés dans le protocole sont nanofibres électrofilées, qui ont des rapports élevés de zone-volume surfaces et adsorbent les analytes à haut rendement. La procédure n’a besoin de quelques milligrammes de nanofibres et un faible volume de solvant de l’éluant et ne nécessite pas une étape d’évaporation se concentrer les analytes. Ici, nous…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par le National Science Foundation de Chine (No.81172720, no 81673230), le Social Development Research Programme of Jiangsu Province Science et Technology department (no. BE2016741), Science & Technology Project de Chine Administration générale de la Supervision de la qualité, Inspection and Quarantine (2015QK055), le programme d’ouvrir un projet de laboratoire clé du développement de l’enfant et l’apprentissage de la Science du ministère de l’éducation, Université du sud-est (CDLS-2016-04). Nous saluons sincèrement Song Yuan et Ping Liu qui nous ont aidés dans la collecte d’échantillons.
Materials
| 200 µL pipette tip | column to contain nanofibers | ||
| PCE-PS nanofibers | material for PFSPE extraction | ||
| steel rod (about 0.5 mm diameter) | fill the nanofibres into the column | ||
| gastight plastic syringe (5 ml) | compress solution into the end of the tip | ||
| methanol | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 67-56-1 | |
| diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA) | Sigma-Aldrich.Inc | A-106408 | complex reagent |
| norepinephrine(NE) | Sigma-Aldrich.Inc | A-9512 | analyte |
| 3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG) | Sigma-Aldrich.Inc | H1377 | analyte |
| epinephrine(E) | Sigma-Aldrich.Inc | 100154-200503 | analyte |
| 3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC) | Sigma-Aldrich.Inc | D-9128 | analyte |
| dopamine(DA) | Sigma-Aldrich.Inc | H-8502 | analyte |
| 3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA) | Sigma-Aldrich.Inc | 858781 | interior label |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich.Inc | 75-05-8 | eluriant and mobile phase |
| phosphoric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7664-38-2 | eluriant |
| uric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 69-93-2 | artifical urine |
| creatinine | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 60-27-5 | artifical urine |
| trisodium citrate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 6132-04-3 | artifical urine |
| KCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7447-40-7 | artifical urine |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 12125-02-9 | artifical urine |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | SWC0140326 | artifical urine |
| C2Na2O4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 62-76-0 | artifical urine |
| NaSO4 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7757-82-6 | artifical urine |
| disodium hydrogen phosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10039-32-4 | artifical urine |
| urea | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 57-13-6 | artifical urine |
| NaCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-14-5 | artifical urine |
| MgSO4.7H2O | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10034-99-8 | artifical urine |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10035-04-8 | artifical urine |
| HCl | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7647-01-0 | artifical urine |
| citric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 77-92-9 | artifical urine and mobile phase |
| EDTA disodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 34124-14-6 | mobile phase |
| monometallic sodium orthophosphate | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 7558-80-7 | artifical urine and mobile phase |
| 1-heptanesulfonic acid sodium salt | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 22767-50-6 | mobile phase |
| sodium hydroxide | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 1310-73-2 | mobile phase |
| phenylboronic acid column(PBA column) | Aglilent | 12102018 | PBA extraction |
| Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm column | Dikma | 5020-06731 | HPLC column for seperation |
| SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLER | Shimadzu Corporation, Japan | SIL-20AC | auto injection for eluriant |
| SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid Chromatography | Shimadzu Corporation, Japan | LC-20AD | HPLC pump |
| SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detector | Shimadzu Corporation, Japan | L-ECD-60A | detector for the analytes |
| ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry System | Micromeritics, USA | surface and porosity analyzer |
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