Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's
Summary
Hier beschrijven we een protocol voor hele mount immunofluorescentie en beeld-gebaseerde kwantitatieve volumetric analysis van vroege fase muis embryo’s. Wij presenteren deze techniek als een krachtige aanpak van kwalitatief en kwantitatief cardiale structuren beoordelen tijdens de ontwikkeling, en voor te stellen dat het wellicht grote schaal aan te passen aan andere orgaansystemen.
Abstract
Het gebruik van steeds voortschrijdende beeldvormingstechnieken heeft over het algemeen bijgedragen aan onze toegenomen kennis van embryonale ontwikkeling. Pre-implantatieontwikkeling en organogenese zijn twee gebieden van onderzoek die sterk van deze voorschotten, als gevolg van de hoge kwaliteit van de gegevens die kan worden verkregen profiteerden hebben vanuit imaging pre-implantatie embryo’s of ex vivo organen. Pre-implantatie embryo’s hebben opgeleverd gegevens met vooral hoge ruimtelijke resolutie, zijn latere stadia geweest minder vatbaar voor driedimensionale wederopbouw. Kwalitatief hoogwaardige 3D- of volumetrische gegevens voor bekende embryonale structuren in combinatie met lot toewijzing of genetische afkomst tracering te verkrijgen zal zorgen voor een meer uitgebreide analyse van de morfogenetische evenementen die plaatsvinden tijdens de embryogenese.
Dit protocol beschrijft een geheel-mount immunofluorescentie aanpak waarmee de labeling, visualisatie en kwantificering van progenitor cel populaties binnen de ontwikkelingslanden cardiale halve maan, een belangrijke structuur gevormd tijdens de ontwikkeling van het hart. De aanpak is zodanig ontworpen dat zowel cel – en weefsel-niveau-informatie kan worden verkregen. Confocal microscopie en beeldverwerking kunt, dit protocol voor driedimensionale ruimtelijke wederopbouw van de cardiale crescent, waardoor de mogelijkheid om het analyseren van de lokalisatie en de organisatie van specifieke voorlopercellen populaties tijdens deze kritieke fase van de ontwikkeling van het hart. Nog belangrijker is, zorgt het gebruik van referentie antilichamen voor opeenvolgende maskeren van de cardiale halve maan en latere kwantitatieve metingen van gebieden binnen de halve maan. Dit protocol wordt niet alleen ingeschakeld met een grondig onderzoek van de vroege ontwikkeling van het hart, maar met aanpassingen gelden de meeste orgaansystemen in het gastrula vroege Somiet stadium muis embryonale.
Introduction
De studie van de organogenese heeft lang vertrouwd op waarneming van morfogenetische gebeurtenissen in het zich ontwikkelende embryo. Deze studies is vaak afhankelijk van het gebruik van fluorescente kleurstoffen of lineage tracering verslaggevers in combinatie met het labelen van gedefinieerde referentie populaties. 1 door de relatieve posities van deze labels te vergelijken, informatie kan worden opgedaan op de oorsprong, beweging of uiteindelijke bijdrage van een bevolking van belang. Transplantatie en lot toewijzing experimenten kunnen morfologische monumenten of injectie van verf in niet-sporenvormende lineages definiëren van het startpunt van de cellen van belang, die vervolgens voor bijdrage aan het ontwikkelde embryo worden onderzocht. 2 , 3 , 4 , 5 genetische afkomst-tracing experimenten gebruik hetzelfde concept met welomschreven verslaggever allelen die worden gebruikt om de label-cel populaties zonder experimentele manipulatie. Sleutel tot deze benaderingen is de mogelijkheid om te bepalen, met hoge ruimtelijke resolutie, de locaties van de experimentele en verwijzing labels. Deze benaderingen hebben opmerkelijke vooruitgang in de pre-implantatieontwikkeling opgeleverd en organogenese studies explant. 6 , 7 , 8 , 9
De ontwikkelingstoxiciteit gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan hart morfogenese zijn steeds goed beschreven in de afgelopen jaren geweest. 10 één van de belangrijke ontdekkingen op het gebied van onderzoek is de beschrijving van een aantal voorlopercellen populaties die kunnen worden onderscheiden door de expressie van unieke markers. 11 deze populaties zijn de eerste en de tweede hart velden (FHF en SHF), die aanwezig is binnen de cardiale halve maan aan de voorste zijde van het embryo ten embryonale dage (E) 8,25 van muis ontwikkeling zijn. 12 deze populaties worden vaak onderzocht door een combinatie van breed-gebied microscopie, waarmee weefsel-niveau informatie, en seriële afdelen met immunofluorescentie testen, die hoge cellulaire resolutie maar alleen biedt tweedimensionale ruimtelijke informatie. 13 aldus, terwijl deze studies zeer ons begrip van de ontwikkeling van het hart geavanceerde hebben, de beschikbare methoden hebben beperkte diepgaande kwantitatieve analyse van genuitdrukking tijdens deze fasen, maken de noodzaak voor benaderingen te onderzoeken de organisatie van deze populaties op het niveau van een geheel-organisme.
De recente vooruitgang in zowel confocale microscopie en 3D beeldanalyse voorzien in een hoge resolutie en hoge gegevensdoorvoer algoritmische reconstructies van de cellen en structuren in situ met relatief gemak, dus de weg vrijmaakt voor gedetailleerde studies van complex cellulaire structuren. 14 met de toename van rekenkracht en de ontwikkeling van grote-data beheren algoritmen, beide nodig om de exponentiële toename van de grootte van de imaging gegevenssets, analyses kunnen nu volledig geautomatiseerd worden. 15 geautomatiseerde analyse van beeldvorming-gegevensverzamelingen, heeft het voordeel dat onbevooroordeelde, maar het is alleen zo betrouwbaar als de kwaliteit van de input dataset; het is dan ook absoluut noodzakelijk dat best practices worden gebruikt tijdens de verwerving en voorbehandeling van de afbeelding om de hoogste kwaliteit, onbevooroordeelde analyse. 16 kunnen protocollen volledig geautomatiseerd en gedeelde voor de reproduceerbaarheid en de algoritmen die worden gebruikt door propriëtaire software gemakkelijk beschikbaar zijn via bibliotheken worden gebruikt door wetenschappers hebben vertrouwdheid met moderne farmaceutische of open-source Ontwikkelaarshulpmiddelen. 17
Het volgende protocol legt de nodige stappen om dergelijke analyses uit te voeren op één welbepaalde model van organogenese, de vorming van de cardiale halve maan tijdens de ontwikkeling van het hart. Specifiek, dit protocol wordt beschreven hoe u (1) oogst en ontleden van cardiale halve maan fase embryo’s, (2) uit te voeren gehele mount immunofluorescentietest voor verwijzing (Nkx2-5) en experimentele (Foxa2Cre:YFP18,19) markeringen, (3) bereiden en beeld van de embryo’s met behulp van de confocal microscopie, en ten slotte (4) analyseren en kwantificeren van de resulterende afbeeldingen met behulp van geavanceerde driedimensionale benaderingen. Terwijl de cardiale halve maan wordt gebruikt als voorbeeld hier, met passende wijziging, kan dit protocol worden gebruikt voor analyse van meerdere lineages in gastrula op vroege Somiet fase embryo’s.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het bovenstaande protocol beschrijft een strategie voor het verkrijgen van kwantitatieve gegevens uit afbeeldingen van hoge kwaliteit hele mount immunofluorescentie van de muis na implantatie embryo’s. Wanneer goed uitgevoerd, kan de 3D volumetrische gegevens gegenereerd door deze stappen worden gebruikt voor vergelijkende en intersectional analyse van meerdere domeinen binnen het embryo. De oppervlakte signaal maskeren beschreven aanpak is vooral nuttig bij het onderzoeken van nieuwe cel populaties in vergelijking met g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de NIH/NHLBI R56 HL128646 en de Mindich Child Health Development Institute (MCHDI) op ISMMS (naar N.D.). E.B. wordt ondersteund door een NIH/NIDCR stage T32 HD075735. Microscopie en beeld-analyse werd uitgevoerd de microscopie kern aan de School of Medicine van Icahn op Mount Sinai, die gedeeltelijk wordt ondersteund door de Tisch Cancer Institute op Mount Sinai P30 CA196521-kanker centrum steun verlenen.
Materials
| Blunt probe | Roboz | RS-9580 | |
| Forceps | Roboz | RS-8100 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5015 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5912 | |
| Saponin | Sigma Aldrich | 84510 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A8022 | |
| Triton | RPI | A4490 | |
| Goat anti-Nkx2-5 | Santa Cruz Biotech | sc-8697 | Used at 1:100-1:500 |
| Chicken anti-GFP | abcam | ab13970 | Used at 1:500 |
| Rabbit anti-Islet1 | abcam | ab109517 | Used at 1:100 |
| Rabbit anti-Hcn4 | Millipore | AB5808 | Used at 1:100 |
| 488 anti-chicken | Jackson Immunoresearch | 703-546-155 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| 555 anti-goat | Thermo Fisher Scientific | A21432 | Used at 1:500 |
| 647 anti-rabbit | Jackson Immunoresearch | 711-606-152 | Reconstituted in water and stored at -20 °C in final concentration of 50% glycerol. Used at 1:500. |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | |
| n-Propyl gallate | Sigma Aldrich | 2370 | Stock solution is 20% w/v in DMSO. Working solution prepared by mixing 1 part 10x PBS with 9 parts 100% glycerol and slowly adding 0.1 part stock solution. |
| Superfrost Plus microscopy slides | VWR Scientific | 48311-703 | |
| 22×22 mm coverslips | VWR Scientific | 48366-227 | |
| Imaris 8.4.1 | Bitplane |
References
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148, 33-45 (2012).
- Tam, P., Parameswaran, M., Kinder, S., Weinberger, R. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Dev Camb Engl. 124, 1631-1642 (1997).
- Lawson, K., Meneses, J., Pedersen, R. Clonal analysis of epiblast fate during germ layer formation in the mouse embryo. Dev Camb Engl. , 891-911 (1991).
- Kinder, S., et al. The orderly allocation of mesodermal cells to the extraembryonic structures and the anteroposterior axis during gastrulation of the mouse embryo. Dev Camb Engl. 126, 4691-4701 (1999).
- Keegan, B. R., Meyer, D., Yelon, D. Organization of cardiac chamber progenitors in the zebrafish blastula. Development. 131, 3081-3091 (2004).
- Saiz, N., Williams, K., Seshan, V., Hadjantonakis, A. -. K. Asynchronous fate decisions by single cells collectively ensure consistent lineage composition in the mouse blastocyst. Nat Commun. 7, 13463 (2016).
- Saiz, N., Kang, M., Schrode, N., Lou, X., Hadjantonakis, A. -. K. Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos. J. Vis. Exp. , e53654 (2016).
- Cullen-McEwen, L. A., et al. Imaging tools for analysis of the ureteric tree in the developing mouse kidney. Methods Mol. Biol. 1075, 305-320 (2014).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. J Vis Exp. , (2016).
- Calderon, D., Bardot, E., Dubois, N. Probing Early Heart Development to Instruct Stem Cell Differentiation Strategies. Dev. Dyn. , (2016).
- Meilhac, S., Lescroart, F., Blanpain, C., Buckingham, M. Cardiac Cell Lineages that Form the Heart. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a013888-a013888 (2014).
- Kelly, R., Buckingham, M., Moorman, A. Heart Fields and Cardiac Morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect. Med. 4, a015750-a015750 (2014).
- Cai, C. -. L., et al. Isl1 Identifies a Cardiac Progenitor Population that Proliferates Prior to Differentiation and Contributes a Majority of Cells to the Heart. Dev Cell. 5, 877-889 (2003).
- Sbalzarini, I. F. Seeing is believing: Quantifying is convincing: Computational image analysis in biology. Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 219, 1-39 (2016).
- Myers, G. Why bioimage informatics matters. Nat. Methods. 9, 659-660 (2012).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological imaging software tools. Nat. Methods. 9, 697-710 (2012).
- Horn, S., et al. Mind bomb 1 is required for pancreatic β-cell formation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 7356-7361 (2012).
- Bardot, E., et al. Foxa2 identifies a cardiac progenitor population with ventricular differentiation potential. Nat Commun. 8, 14428 (2017).
- Adams, M. W., Loftus, A. F., Dunn, S. E., Joens, M. S., Fitzpatrick, J. A. J. Light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Curr. Protoc. Cytom. 2015, (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Curr. Protoc. Cytom. , (2012).
- Burtscher, I., Lickert, H. Foxa2 regulates polarity and epithelialization in the endoderm germ layer of the mouse embryo. Development. 136, 1029-1038 (2009).
- Baron, M. H., Mohn, D. Mouse embryonic explant culture system for analysis of hematopoietic and vascular development. Methods Mol. Med. 105, 231-256 (2005).
