Meten van Influenza neutraliserende antilichamen reacties op A(H3N2) virussen in menselijke Sera door Microneutralization testen met behulp van MDCK-SIAT1 cellen
Summary
Influenza neutraliserende antilichamen correleren met bescherming van influenza-infecties. Microneutralization testen meten van neutraliserende antilichamen in menselijke sera en worden vaak gebruikt voor menselijke influenza-serologie. We beschrijven een microneutralization assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van neutraliserende antilichamen titers voor hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen na griepvaccinatie of infectie.
Abstract
Neutraliserende antilichamen tegen hemagglutinine (HA) van influenza-virussen worden beschouwd als het belangrijkste immuun mechanisme dat met bescherming van influenza-infecties correleert. Microneutralization (MN) tests worden vaak gebruikt voor het meten van neutraliserende antilichamen reacties in menselijke sera na griepvaccinatie of infectie. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cellen zijn het meest gebruikte cel substraat voor MN testen. Echter op dit moment circuleren 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) influenza virussen hebben verworven gewijzigd receptor bindende specificiteit. De cellijn van de MDCK-SIAT1 met verhoogde α-2,6 sialic galactose wordt op het oppervlak heeft bewezen om verbeterde infectiviteit en meer trouw replicaties dan conventionele MDCK cellen voor deze hedendaagse A(H3N2) virussen. Hier beschrijven we een MN assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 die is geoptimaliseerd om te kwantificeren van neutraliserende antilichamen titers voor deze hedendaagse A(H3N2) virussen. In dit protocol, worden warmte geïnactiveerd sera met neutraliserende antilichamen eerst serieel verdund, vervolgens geïncubeerd met 100 TCID50/goed van de A(H3N2)-influenzavirussen om antilichamen in de sera te binden aan de virussen. MDCK-SIAT1 cellen worden vervolgens toegevoegd aan het mengsel van virus-antilichaam en 18-20 h bij 37 ° C, 5% CO2 toe A(H3N2) virussen te infecteren MDCK-SIAT1 cellen ge¨ uncubeerd. Na een incubatieperiode van overnachting, platen worden opgelost en de hoeveelheid virus in elk goed wordt gekwantificeerd door een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) met behulp van anti-griep een nucleoproteïne (NP) monoklonale antilichamen. Neutraliserende antilichamen titer wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de hoogste serumverdunning waarmee ≥50% remming van de besmettelijkheid van het virus.
Introduction
Influenzavirussen blijven morbiditeit en mortaliteit in de menselijke bevolking jaarlijks veroorzaken. HA is de grote oppervlakte glycoproteïne influenza virussen. Neutraliserende antilichamen gericht op HA zijn de belangrijkste immuun mechanisme dat met bescherming voor influenza infecties1,2 correleert. Hemagglutination inhibitie (HI) testen en MN vitrotests zijn twee methoden gebruikte voor het meten van antilichaam reacties in menselijke sera na de infectie of vaccinatie griep3. De HI-test meet antilichaam inhibitie van virus hemagglutination van rode bloedcellen en wordt beschouwd als een surrogaat assay. In tegenstelling tot HI, kan de bepaling van MN direct de niveaus van antilichamen in menselijke sera die neutraliseren van besmetting van de griep in celculturen meten. MDCK cellen worden vaak gebruikt in de isolatie van het virus van de griep en MN testen4.
Influenzavirussen worden voortdurend antigene drift en shift, verwerven van mutaties op HA eiwitten die de receptor bindende specificiteit van virussen veranderen kunnen ondergaan. Sinds 2014 nieuwe clusters van A(H3N2) virussen ontstaan en blijven circuleren tot het huidige seizoen. De meeste van deze virussen behoren tot de genetische groep 3C.2a en 3C.3a gebaseerd op de fylogenetische analyse van de HA-eiwitten. Veel van de circulerende virussen 3C.2a had verminderd vermogen om hemagglutinate van rode bloedcellen en daarmee kunnen niet worden gekenmerkt door HI assays5. Neutralisatie testen moeten worden gebruikt voor het meten van de antilichaam-reacties op deze virussen die niet6 hemagglutinate doen. Bovendien, studies hebben aangetoond dat deze hedendaagse A(H3N2) virussen receptor bindende eigenschappen vergeleken met eerdere A(H3N2) virussen hebben veranderd en hebben de neiging om te accumuleren cultuur aangepast mutaties en polymorfisme bij gepasseerd in in vitro cel culturen7,8,9. Vergeleken met conventionele MDCK cellen, is MDCK-SIAT1 een cellijn ontwikkeld door Matrosovich et al. door de stabiele transfectie MDCK cellen met cDNA van menselijke alpha2, 6-sialtransferase (SIAT1). Deze cellijn spreekt verhoogde hoeveelheden alpha2, 6-sialic galactose wordt en verminderde hoeveelheid alpha2, 3-sialic zuur wordt dan het bovenliggende MDCK cellen10. Cellen van de MDCK-SIAT1 gebleken om isolatie tarieven voor A(H3N2) virussen in vergelijking met MDCK cellen11. Onlangs, Lin et al. gerapporteerd dat onlangs naar voren gekomen 3C.2a en 3C.3a menselijke A(H3N2) influenza virussen, meer trouwe virus replicaties en betere virus infectiviteit werden bereikt wanneer virussen gekweekt in cellijnen van de MDCK-SIAT1 in vergelijking met MDCK cellen7 werden. De MDCK-SIAT1 cellen zijn dus beter geschikt in MN testen te karakteriseren van antilichaam reacties op de recente clusters van A(H3N2) virussen.
Hier beschrijven we een MN-assay cuvetten van de MDCK-SIAT1 voor het meten van antilichaam reacties op hedendaagse 3C.2a en 3C.3a A(H3N2) virussen in menselijke sera. Virussen gegroeid in eieren of cellen kunnen worden gebruikt in deze test. Warmte geïnactiveerd sera met neutraliserende antilichamen worden eerst serieel verdund, vervolgens geïncubeerd met 100 TCID50/goed van A(H3N2) influenzavirus om antilichamen in de sera te binden aan het virus. MDCK-SIAT1 cellen worden vervolgens toegevoegd aan het mengsel van virus-antilichaam en 18-20 h bij 37 ° C, 5% CO2 om het A(H3N2)-virus besmetten MDCK-SIAT1 cellen te repliceren ge¨ uncubeerd. Na een incubatieperiode van overnachting, de platen worden opgelost en de hoeveelheid virus in elk putje wordt gekwantificeerd door een ELISA met anti-influenza A NP monoklonale antilichamen. De detectie van NP geeft aan de aanwezigheid van virusinfectie en het ontbreken van neutraliserende antilichamen. Neutraliserende antilichamen titer wordt gedefinieerd als de reciproque waarde van de hoogste serumverdunning waarmee ≥ 50% remming van de besmettelijkheid van het virus.
Protocol
Representative Results
Discussion
De bepaling van MN is een van de belangrijkste tests voor influenza serologie gebruikt voor het opsporen van antilichamen reacties na besmetting van de griep of vaccinatie. Titers gegenereerd op basis van MN tests worden vaak gebruikt als de primaire uitkomst van veel griep seroepidemiology studies. MN tests worden ook op grote schaal gebruikt voor sero-diagnose, en de evaluatie van de immunogeniciteit van het vaccin. Internationale inter lab studies zijn uitgevoerd om te vergelijken van MN testen uitgevoerd in meerdere …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu en Ms. Ashley Burroughs van de Influenza-divisie van de CDC voor hun kritische evaluatie en bijstand ter voorbereiding van dit manuscript. Wij danken Dr. Adrian Reber van Influenza afdeling van de CDC voor zijn hulp bij de voorbereiding van de grafische vormgeving van Figuur 3. Tot slot bedanken wij Dr. M. Matrosovich, Marburg, Duitsland voor het verstrekken van de MDCK-SIAT1 cellen.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
Referências
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
