Messung der Influenza neutralisierenden Antikörperantworten gegen a/H3N2-Viren im menschlichen Serum von Microneutralization Assays mit MDCK-SIAT1 Zellen
Summary
Grippe neutralisierende Antikörper korrelieren mit dem Schutz der Influenza-Infektionen. Microneutralization Assays messen neutralisierende Antikörper im menschlichen Serum und dienen oft der menschlichen Grippe-Serologie. Wir beschreiben einen Microneutralization-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen um zu messen, neutralisierende Antikörpertiter zu zeitgenössischen 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren nach Influenza-Impfung oder Infektion.
Abstract
Neutralisierende Antikörper gegen Hämagglutinin (HA) von Influenza-Viren werden die wichtigsten Immunmechanismus angesehen, die mit Schutz für Influenza-Infektionen korreliert. Microneutralization (MN) Assays werden häufig verwendet, um neutralisierende Antikörperreaktionen im menschlichen Serum nach Influenza-Impfung oder Infektion zu messen. Verdeckte Darby Canine Kidney (MDCK) Zellen sind die häufigsten verwendeten Zelle Substrat für MN-Assays. Allerdings verändert die derzeit zirkulierenden 3C.2a und 3C.3a a/H3N2 Influenza Viren erworbenen Rezeptorspezifität Bindung. Die MDCK-SIAT1-Zell-Linie mit erhöhten α-2,6 sialic Galaktose Moieties auf der Oberfläche erweist sich verbesserte Infektiosität und treuere Repliken als herkömmliche MDCK-Zellen für diese zeitgenössischen a/H3N2-Viren zur Verfügung. Hier beschreiben wir eine MN-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen, die zu neutralisierende Antikörpertiter zu dieser zeitgenössischen a/H3N2-Viren quantifizieren optimiert wurde. In diesem Protokoll sind Hitze inaktiviert Sera, neutralisierende Antikörper enthält zunächst seriell verdünnt dann inkubiert mit 100 TCID50/gut von Influenza a/H3N2-Viren Antikörper im Sera binden an die Viren ermöglichen. MDCK-SIAT1 Zellen sind dann die Virus-Antikörper-Mischung hinzugefügt und inkubiert für 18-20 h bei 37 ° C, 5 % CO2 , a/H3N2-Viren MDCK-SIAT1 Zellen infizieren können. Nach der Inkubation über Nacht, sind Platten fixiert und der Virusmenge in jedem gut durch ein Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay (ELISA) mit Anti-Grippe quantifiziert ist ein monoklonaler Antikörper Nucleoprotein (NP). Neutralisierende Antikörpertiter ist definiert als der Kehrwert der höchsten Serum Verdünnung, die ≥50 % Hemmung der Virus Infektiosität bereitstellt.
Introduction
Influenza-Viren weiterhin Morbidität und Mortalität in der Bevölkerung jedes Jahr verursachen. HA ist die große Oberfläche Glykoprotein von Influenza-Viren. Neutralisierende Antikörper gezielt HA sind die wichtigsten Immunmechanismus, die mit dem Schutz der Influenza-Infektion1,2korreliert. Hämagglutination Inhibition (HI) Assays und MN-Assays sind zwei Methoden, die häufig verwendet, um Antikörperreaktionen im menschlichen Serum nach Grippe-Infektion oder Impfung3messen. Die HI-Assay misst Antikörper Hemmung der Virus Hämagglutination der roten Blutkörperchen und gilt als einen Surrogat-Assay. Im Gegensatz zu HI kann die MN-Assay direkt die Ebenen von Antikörpern im menschlichen Serum messen, die Influenza-Infektion in Zellkulturen zu neutralisieren. MDCK-Zellen dienen häufig Influenza Virus isoliert und MN assays4.
Influenza-Viren werden ständig Antigendrift und Shift, Erwerb von Mutationen auf HA-Proteine, die verbindliche Rezeptorspezifität Viren verändern können. Seit 2014 neue Cluster a/H3N2-Viren entstanden und weiter bis zur aktuellen Saison zirkulieren. Die meisten dieser Viren gehören zu den genetischen Gruppe 3C.2a und 3C.3a basierend auf phylogenetische Analyse der HA Proteine. Viele der zirkulierenden Viren 3C.2a Fähigkeit, die roten Blutkörperchen hemagglutinate reduziert hatte und daher können nicht von HI-Assays5geprägt sein. Neutralisation Assays müssen verwendet werden, um die Antikörperreaktionen auf diese Viren zu messen, die nicht6hemagglutinate. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass diese zeitgenössischen a/H3N2-Viren Rezeptor bindende Eigenschaften im Vergleich zu früheren a/H3N2-Viren verändert und neigen dazu haben, Kultur angepasst Mutationen und Polymorphismus bei in in-vitro- Zellen passagiert akkumulieren Kulturen7,8,9. Verglichen mit konventionellen MDCK-Zellen, ist MDCK-SIAT1 eine Zell-Linie von Matrosovich Et Al. entwickelt durch stabile Transfektion von MDCK Zellen mit cDNA des menschlichen α2, 6-Sialtransferase (SIAT1). Diese Zelllinie drückt erhöhte Mengen an α2, 6-sialic Galaktose Moieties und geringere Mengen an α2, 3 sialic Acid Moieties als das übergeordnete Element MDCK Zellen10. MDCK-SIAT1 Zellen haben gezeigt, um Isolierung Preise für a/H3N2-Viren im Vergleich zu MDCK Zellen11zu verbessern. Vor kurzem, Lin Et al. berichtet, dass für frisch geschlüpfte 3C.2a und 3C.3a menschlichen a/H3N2 Influenzaviren, treuer Virus Replikationen und bessere Virus Infektiosität erreicht wurden, wenn Viren in MDCK-SIAT1-Zell-Linien im Vergleich zu MDCK Zellen7kultiviert wurden. Somit eignen sich die MDCK-SIAT1 Zellen besser in MN-Assays Antikörperantworten den jüngsten Clustern von a/H3N2-Viren zu charakterisieren.
Hier beschreiben wir eine MN-Assay mit MDCK-SIAT1 Zellen zu Antikörperreaktionen auf zeitgenössische 3C.2a und 3C.3a a/H3N2-Viren im menschlichen Serum messen. Viren, die in Eiern oder Zellen gewachsen können in diesem Test verwendet werden. Hitze inaktiviert Sera, neutralisierende Antikörper enthält sind zunächst seriell verdünnt, dann inkubiert mit 100 TCID50/gut von Influenza-a/H3N2-Virus Antikörper im Serum, um das Virus zu binden zu ermöglichen. MDCK-SIAT1 Zellen sind dann die Virus-Antikörper-Mischung hinzugefügt und für 18-20 h bei 37 ° C, 5 % CO2 erlauben das a/H3N2 Virus MDCK-SIAT1 Zellen infizieren und replizieren inkubiert. Nach der Inkubation über Nacht die Platten werden fixiert und der Virusmenge in jede Vertiefung wird von einem ELISA mit Anti-Grippe A NP monoklonalen Antikörpern quantifiziert. Die Erkennung von NP zeigt das Vorhandensein des Virus-Infektion und das Fehlen von neutralisierenden Antikörpern. Neutralisierende Antikörpertiter ist definiert als der Kehrwert der höchsten Serum Verdünnung, die ≥ 50 % Hemmung der Virus Infektiosität bereitstellt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die MN-Assay ist eines der wichtigsten Assays für Influenza Serologie zur Antikörperantworten nach Influenza-Infektion oder Impfung eingesetzt. Titer von MN-Assays generiert werden oft als die primären Endpunkt vieler Grippe Seroepidemiology Studien verwendet. MN-Assays sind auch für Sero-Diagnostik und der Bewertung der Impfstoff Immunogenität verbreitet. Internationalen Inter Lab Studien wurden durchgeführt, um MN Assays trat in mehreren Laboratorien14zu vergleichen.
<p class="jove_con…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu und Frau Ashley Burroughs aus der Influenza-Division des CDC für ihre kritische Überprüfung und Unterstützung bei der Vorbereitung dieser Handschrift. Wir danken Dr. Adrian Reber von Influenza Division des CDC für seine Hilfe bei der Vorbereitung der Grafik in Abbildung 3. Zu guter Letzt bedanken wir uns bei Dr. M. Matrosovich, Marburg, Deutschland für die Bereitstellung der MDCK-SIAT1-Zellen.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
Referências
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