사용 하 여 MDCK SIAT1 세포 분석 실험 측정 인플루엔자 항 체 응답 Microneutralization에 의해 인간의 세라에 A(H3N2) 바이러스를 중화
Summary
인플루엔자 중화 항 체는 인플루엔자 감염의 보호와 연관. Microneutralization 분석 실험 인간 혈 청의 중화 항 체를 측정 하 고 자주 독감 인간의 혈 청 학에 대 한 사용 됩니다. 인플루엔자 예방 접종 또는 감염 다음 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 측정 MDCK-SIAT1 세포를 사용 하 여 microneutralization 분석 결과 설명 합니다.
Abstract
조류 독감 바이러스 (HA)에 대 한 중화 항 체는 인플루엔자 감염에 대 한 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘으로 간주 됩니다. Microneutralization (미네소타) 분석 실험 자주 독감 예방 접종 또는 감염 후 인간의 혈 청의 중화 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 됩니다. Madine 다 비 개 신장 (MDCK) 세포는 미네소타 분석 실험에 대 한 일반적으로 사용 되 셀 기판. 그러나, 현재 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 인플루엔자 바이러스 획득 순환 수용 체 바인딩 특이성 변경. 표면에 증가 된 α-2, 6 sialic 갈 락 토스 moieties로 MDCK SIAT1 셀 라인은 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스에 대 한 향상 된 infectivity 기존의 MDCK 셀 보다 더 충실 한 복제를 제공을 입증 했다. 여기, 우리는 미네소타 분석 결과 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스 중화 항 체 titers 계량 하도록 최적화 된 설명 합니다. 이 프로토콜 열 비활성화 세라 중화 항 체를 포함 하는 먼저 순차적으로 희석, 다음 100 TCID50/인플루엔자 바이러스에 바인딩할 세라에 항 체를 수 있도록 A(H3N2)의 인 큐베이 팅. MDCK-SIAT1 셀 다음 바이러스 항 체 혼합물에 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 A(H3N2) 바이러스 MDCK SIAT1 세포를 감염 시킬 수 있도록에서 18-20 h에 대 한 인 큐베이 팅. 하룻밤 배양 후 플레이트 고정 되 고 각 바이러스의 양을 잘 효소 연결 된 immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 항 인플루엔자를 사용 하 여 계량은 nucleoprotein (NP) 단일 클론 항 체. 중화 항 체 titer 바이러스 infectivity의 50% 억제를 제공 하는 높은 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.
Introduction
인플루엔자 바이러스는 인간의 인구 매년 사망률 및 사망 원인을 계속. 하는 인플루엔자 바이러스의 주요 표면 당단백질. HA를 대상으로 하는 중화 항 체는 인플루엔자 감염1,2의 보호와 상관 관계가 주요 면역 메커니즘입니다. Hemagglutination 억제 (HI) 분석 실험 및 MN 분석 널리 인플루엔자 감염이 나 예방 접종3후 인간의 혈 청에 항 체 응답을 측정 하는 데 사용 하는 두 가지 방법이 있습니다. 이 분석 결과 붉은 혈액 세포의 바이러스 hemagglutination의 항 체 억제를 측정 하 고 분석 결과 대리 하는 것으로 간주 됩니다. 안녕, 달리 미네소타 분석 결과 직접 인간의 세라 셀 문화에서 인플루엔자 감염을 중화 하는 항 체의 수치를 측정할 수 있습니다. MDCK 셀 인플루엔자 바이러스 분리에 자주 사용 하 고 미네소타 분석 실험4.
인플루엔자 바이러스는 지속적으로 antigenic 드리프트와 shift, 바이러스의 수용 체 의무적인 특이성을 변경할 수 있는 HA 단백질에 돌연변이 인수 받 다. 2014 년 이후 A(H3N2) 바이러스의 새로운 클러스터 등장 하 고 현재 시즌까지 회람 하기 위하여 계속 했다. 이 바이러스의 대부분은 유전 그룹 3C.2a와 3C.3a HA 단백질의 계통 발생 분석에 기반에 속한다. 순환 3C.2a 바이러스의 많은 hemagglutinate 붉은 혈액 세포 수를 감소 했다 고이 분석 실험5에 의해 특성화 될 수 없습니다. 중립화 분석6hemagglutinate 하지 않는 이러한 바이러스에 항 체 응답을 측정 하기 위해 사용 되어야 한다. 또한, 연구는 이러한 현대 A(H3N2) 바이러스 수용 체 바인딩 속성 이전 A(H3N2) 바이러스에 비해 변경 및 문화 적응 돌연변이 및 다형성 체 외에서 세포에 passaged 때 축적 하는 경향이 나타났습니다. 문화7,,89. 기존의 MDCK 세포와 비교 하면, MDCK-SIAT1는 Matrosovich 그 외 여러분 에 의해 개발 된 셀 라인 인간의 α2, 6-sialtransferase (SIAT1)의 cDNA와 MDCK 세포의 안정 되어 있는 transfection을 통해 이 셀 라인 α2, 6 sialic 갈 락 토스 moieties 및 α2, MDCK 셀10부모 보다 3 sialic acid moieties 감소 금액의 증가 양을 표현 한다. MDCK-SIAT1 세포 MDCK 세포11에 비해 A(H3N2) 바이러스에 대 한 격리 속도 향상 시킬 나타났습니다. 최근, 린 외. 보고는 새로 등장 3C.2a 및 3C.3a 인간 A(H3N2) 인플루엔자 바이러스, 더 충실 한 바이러스 복제와 더 나은 바이러스 infectivity 달성 했다 바이러스 MDCK SIAT1 셀 라인 MDCK 셀7와 비교에 교양 있었다. 따라서, MDCK-SIAT1 세포는 더 미네소타 A(H3N2) 바이러스의 최근 클러스터에 대 한 항 체 응답 특성 분석에 적합 합니다.
여기 현대 3C.2a 및 3C.3a A(H3N2) 바이러스 인간 혈 청에 항 체 응답을 측정 하기 위해 MDCK SIAT1 셀을 사용 하 여 MN 분석 결과 설명 합니다. 이 분석 결과에 계란 또는 세포에서 바이러스를 사용할 수 있습니다. 열 비활성화 세라 중화 항 체를 포함 하는 먼저 순차적으로 희석, 다음 100 TCID50/인플루엔자 바이러스에 바인딩할 세라에 항 체를 수 있도록 A(H3N2)의 인 큐베이 팅. MDCK-SIAT1 셀 다음 바이러스 항 체 혼합물에 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 A(H3N2) 바이러스 MDCK SIAT1 세포를 감염 하 고 복제를 허용 하도록에서 18-20 h에 대 한 인 큐베이 팅. 야간 보육, 후 판을 고정 하 고는 ELISA 항 인플루엔자 A NP 단일 클론 항 체를 사용 하 여 각 우물에서 바이러스의 양을 계량은. NP의 감지 바이러스 감염의 존재와 항 체를 중화의 부재를 나타냅니다. 중화 항 체 titer 바이러스 infectivity ≥ 50% 억제를 제공 하는 높은 혈 청 희석의 상호로 정의 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
MN 분석 결과 인플루엔자 혈 청 학에 대 한 인플루엔자 감염이 나 예방 접종을 다음과 같은 항 체 응답을 검색 하는 데 사용 하는 주요 분석 실험 중 하나입니다. 많은 인플루엔자 seroepidemiology 연구의 주요 결과 titers MN 분석 실험에서 생성 된 자주 사용 됩니다. MN 분석 sero 진단 및 백신 immunogenicity의 평가 또한 널리 사용 됩니다. 국제 간 연구소 연구14여러 실험실 수행 하는 미네소?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리이 원고 준비 박사 Xiuhua Lu, 박사 펭 류, 및 그들의 중요 한 검토 및 지원에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 양 애슐리 버로우즈 감사합니다. 우리는 그림 3의 그래픽을 준비 하 고 그의 도움에 대 한 질병 통제 센터의 독감 부문에서 박사 아드리안 Reber 감사. 마지막으로, 우리는 박사 M. Matrosovich, Marburg, 독일 MDCK SIAT1 세포를 제공 하기 위한 감사 합니다.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) with high Glucose | Life Science | 11965 | A critical component of Sterile Cell Culture, Virus Propagation and Virus Diluent Media |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Fraction V, Protase Free | Sigma-Aldrich | 3117332001 | |
| L-Glutamine | Life Science | 25030-081 | |
| Sodium pyruvate | Life Science | 11360-070 | |
| Geneticin G-418 disulfate salt | Sigma-Aldrich | A1720-5G | |
| HEPES | Life Science | 15630-080 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Science | 15140-122 | |
| Acetone | VWR | 67-64-1 | Used at an 80% concentration |
| Phosphate-Citrate Buffer with Sodium Perborate | Sigma-Aldrich | SLBF2806V | |
| O-Phenylenediamine Dihydrochloride tablet | Sigma-Aldrich | SLBQ1086V | 1 tablet per 100ml of cell culture grade water |
| Sulfuric Acid | Fisher Scientific | A510-P500 | Used 0.5M final concentration |
| Ethanol, Denatured, 4L | VWR | EM-AX0422-3 | Used at an 70% concentration |
| Trypsin-EDTA | Life Science | 1748048 | |
| RDE II "Seiken" | Denka Seiken | 370013 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379-500ml | |
| Anti-NP mouse monoclonal Ab | Millipore pool | MAB 8257 MAB 8258 | |
| Anti-mouse IgG HRP | KPL | 074-1802 | |
| 96-well flat-bottom plates | Thermo Scientific | 3455 | |
| Plate reader | Molecular Device | Spectromax 384 plus | |
| Cell Culture Flask 162 cm2/Vent Cap | Corning/VWR | 3151 |
Referências
- Reber, A., Katz, J. Immunological assessment of influenza vaccines and immune correlates of protection. Expert Rev of Vaccines. 12, 519-536 (2013).
- Li, C. K., Rappuoli, R., Xu, X. N. Correlates of protection against influenza infection in humans–on the path to a universal vaccine?. Curr Opin in Immunol. 25, 470-476 (2013).
- WHO Global Influenza Surveillance Network. . Manual for the labratory diagnosis and virological surveillence of influenza. , (2011).
- Govorkova, E. A., Kodihalli, S., Alymova, I. V., Fanget, B., Webster, R. G. Growth and immunogenicity of influenza viruses cultivated in Vero or MDCK cells and in embryonated chicken eggs. Dev Biological Stand. 98, 39-51 (1999).
- Levine, M. Z., et al. Neutralizing Antibody Responses to Antigenically Drifted Influenza A(H3N2) Viruses among Children and Adolescents following 2014-2015 Inactivated and Live Attenuated Influenza Vaccination. Clin Vaccine Immunol : CVI. 23, 831-839 (2016).
- Lin, Y., et al. The characteristics and antigenic properties of recently emerged subclade 3C.3a and 3C.2a human influenza A(H3N2) viruses passaged in MDCK cells. Influenza Other Respir Viruses. , (2017).
- Lin, Y. P., et al. Neuraminidase receptor binding variants of human influenza A(H3N2) viruses resulting from substitution of aspartic acid 151 in the catalytic site: a role in virus attachment?. J of Virol. 84, 6769-6781 (2010).
- Skowronski, D. M., et al. Mutations acquired during cell culture isolation may affect antigenic characterisation of influenza A(H3N2) clade 3C.2a viruses. Euro Surveillance. 21, 30112 (2016).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Carr, J., Roberts, N. A., Klenk, H. D. Overexpression of the alpha-2,6-sialyltransferase in MDCK cells increases influenza virus sensitivity to neuraminidase inhibitors. J of Virol. 77, 8418-8425 (2003).
- Oh, D. Y., Barr, I. G., Mosse, J. A., Laurie, K. L. MDCK-SIAT1 cells show improved isolation rates for recent human influenza viruses compared to conventional MDCK cells. J Clin Microbiol. 46, 2189-2194 (2008).
- US Department of Health and Human Services. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. , (2009).
- Reed, H. M. A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, (1938).
- Laurie, K. L., et al. International Laboratory Comparison of Influenza Microneutralization Assays for A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and A(H5N1) Influenza Viruses by CONSISE. Clinical Vaccine Immunol : CVI. 22, 957-964 (2015).
- Lin, Y., Gu, Y., McCauley, J. W. Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay. J Vis Exp : JoVE. , (2016).
- van Baalen, C. A., et al. ViroSpot microneutralization assay for antigenic characterization of human influenza viruses. Vaccine. 35, 46-52 (2017).
