Usando el análisis de punto para analizar la migración de células de hojas
Summary
Migración celular es esencial para el desarrollo, mantenimiento de tejidos y reparación y tumorigenesis y está regulada por factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas. Este protocolo describe el ensayo de punto, un análisis de la migración de dos dimensiones, sin restricciones para evaluar el fenotipo migratorio de hojas adjunta, cohesivo de la célula en respuesta a señales microambiental.
Abstract
Aunque organismos complejos aparecen estáticos, sus tejidos están bajo una rotación continua. Como las células de edad, mueren y son reemplazados por nuevas células, las células se mueven dentro de los tejidos de una manera bien orquestada. Durante el desarrollo del tumor, este equilibrio es perturbado, y salir de las células del tumor del epitelio de origen, para invadir el microambiente local, viajar a sitios distantes y en última instancia formar tumores metastásicos en sitios distantes. El punto es un análisis simple, de dos dimensiones de la migración sin restricciones, para evaluar el movimiento neto de las hojas de la célula en una zona libre de células y para analizar parámetros de migración de la célula usando proyección de imagen de Time-lapse. Aquí, el análisis de punto se demuestra con un humano invasor, línea de células de cáncer de mama, MCF10CA1a, formadoras de pulmón para analizar migratorias ante las células factor de crecimiento epidérmico (EGF), que se sabe para aumentar el potencial maligno de las células de cáncer de mama y para alterar el fenotipo migratorio de las células.
Introduction
Ensayos de migración son ampliamente utilizados para evaluar el potencial invasivo y metastásico de las células de tumor en vitro. Por lo general, la herida o rasguño de análisis se utilizan para evaluar la migración de hojas epiteliales en un celular autorizado zona1,2,3. Para realizar el ensayo de rayado, las células se platean en una monocapa y se crea un “cero” o zona libre de células con una punta de pipeta. El ensayo de rayado es fácil de configurar con suministros de cultivo de tejidos comúnmente disponibles y puede ser realizado en placas de varios pocillos, permitiendo para el procesamiento de muestras múltiples. Sin embargo, mientras se hace la raya, las células se quitan físicamente de la monocapa y someterse a menudo a la muerte celular. Además, matriz extracelular, conectada a la placa a menudo se daña durante el proceso de raspado. Asimismo, el uso de silicona rellenos (tales como Ibidi cámaras4) o de plantillas de5,6,7 puede conducir a la interrupción mecánica de las células y la eliminación parcial de las proteínas de la matriz utilizada para el recubrimiento de la placas. Otra desventaja de ensayos de control de cierre de las heridas o rasguños es su curso de tiempo limitado, como la migración de la célula sólo puede ser analizada hasta que se cierre el cero.
Al realizar el ensayo de punto, las células se platean como Colonia circular en una placa cubierta o sin recubrimiento8. La razón fundamental de esta estrategia de la galjanoplastia es obtener hojas de células con bordes definidos, que pueden migrar o invadir en los alrededores libres de células sin molestar a la cultura por la eliminación de las células o partes movibles. El objetivo general de la prueba de dot es observar la migración de hojas de celular medida por el desplazamiento del borde o diámetro de Colonia, así como para realizar Time-lapse de imágenes para analizar el fenotipo migratorio de las células en mayor resolución espacio-temporal.
Migración de la célula puede verse afectada por una variedad de señales microambiental como quimiocinas, citoquinas y factores de crecimiento como el EGF. EGF es un factor de crecimiento que ejerce sus efectos biológicos por Unión a su receptor, del receptor de EGF9y aumenta el comportamiento invasivo y metastásico de tumor las células4,9,10. Aquí, el ensayo del punto se utiliza para el estudio de EGF estimula la migración de la célula en un humano invasor, pulmón formadoras mama cáncer célula línea (MCF10CA1a)8,11,12.
Protocol
Representative Results
Discussion
En las células de la progresión del tumor migran fuera del tejido de origen, para invadir el tejido circundante y metastatizar a sitios distantes15. Migración de células de una colonia de células se observan en el análisis del punto. Aquí, el análisis de punto se ilustra mediante el análisis del fenotipo migratorio de las células de cáncer de mama humano en respuesta al EGF.
Para obtener resultados precisos y reproducibles en varios pasos en la configuración…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El autor desea agradecer Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo y Carole Parent para leer y comentar el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación Intramural del Instituto Nacional del cáncer, institutos nacionales de salud.
Materials
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for asay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| LPA (1-Oleoyl Lysophosphatidic Acid ) | Cayman | 10093 | used to stimulate cells |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for LPA and EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
Referências
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