Een Seminiferous zaadvormende Squash techniek voor de cytologische analyse van de spermatogenese met behulp van het muismodel
Summary
Het doel van deze zaadvormende squash techniek is te snel beoordelen cytologische kenmerken van ontwikkeling van muis spermatocyten cellulaire integriteit aan te tasten. Deze methode zorgt voor de studie van alle stadia van de spermatogenese, en kan gemakkelijk worden toegepast naast andere biochemische en moleculaire biologische benaderingen voor de studie van muis meiose.
Abstract
Meiotische progressie bij mannen is een proces dat de gezamenlijke actie van een aantal sterk gereguleerde cellulaire gebeurtenissen vereist. Fouten die zich voordoen tijdens de meiose kunnen leiden tot onvruchtbaarheid, zwangerschap verlies of genetische afwijkingen. Te beginnen bij het begin van de puberteit en blijft tijdens volwassenheid, continu halfsynchrone golven van spermatocyten spermatogenese ondergaan en uiteindelijk vormen haploïde sperma. De eerste golf van muis spermatocyten ondergaan Meiotische initiatie verschijnen op dag 10 post-partum (10 dpp) en worden uitgebracht in het lumen van seminiferous buisjes als volwassen sperma op 35 dpp. Daarom is het voordeligste muizen binnen dit ontwikkelings tijd-venster gebruiken om het verkrijgen van hoogverrijkt populaties van belang. Analyse van zeldzame cel stadia is moeilijker in oudere muizen als gevolg van de bijdrage van opeenvolgende in golven, die de diversiteit van de cellulaire bevolking binnen de tubuli te verhogen. De hier beschreven methode is een gemakkelijk uitgevoerde techniek voor de cytologische beoordeling van de cellen binnen de seminiferous buisjes van muizen, waaronder testis, spermatocyten en spermatids gevonden. De zaadvormende squash techniek handhaaft de integriteit van geïsoleerde mannelijke geslachtscellen en laat onderzoek van cellulaire structuren die niet gemakkelijk met andere technieken worden gevisualiseerd. Om aan te tonen van de mogelijke toepassingen van deze zaadvormende squash techniek, werd spindel vergadering gecontroleerd in de profase aan metafase die ik overgang modeltraject spermatocyten (overgang van G2/MI). Daarnaast, werden centrosoom duplicatie, Meiotische sex chromosoom inactivering (MSCI) en chromosoom boeket vorming beoordeeld als voorbeelden van de cytologische structuren die kunnen worden waargenomen met behulp van deze methode zaadvormende squash. Deze techniek kan worden gebruikt voor het lokaliseren van specifieke gebreken tijdens spermatogenese die worden veroorzaakt door mutatie of exogene perturbation, en dus, draagt bij aan onze moleculaire begrip van de spermatogenese.
Introduction
Meiose is een complexe cellulaire evenement waarin een ronde van DNA-replicatie wordt gevolgd door twee opeenvolgende ronden van de celdeling. Verschillende meiose-specifieke gebeurtenissen moet tijdens de eerste stadia van meiose om ervoor te zorgen nauwkeurige chromosoom segregatie gecoördineerd zijn. Deze gebeurtenissen omvatten de voltooiing van homologe recombinatie, mede richting van zuster kinetochoren tijdens de eerste Meiotische klasse, en de stapsgewijze verlies van cohesin complexen op te lossen chiasmata tussen homologen. Precieze regulatie van deze processen is noodzakelijk om vruchtbaarheid en ter voorkoming van chromosoom missegregation gebeurtenissen die tot genetische ontwikkelingsstoornissen en spontane miskraam1 leiden kunnen.
Terwijl de belangrijkste gebeurtenissen van meiose in zowel mannen als vrouwen plaatsvindt, bestaan temporele en mechanistische verschillen tussen spermatogenese en ooegenese2. Bijvoorbeeld, tijdens de vrouwelijke meiose, profase I optreedt tijdens de embryonale ontwikkeling en arrestaties in het stadium van de dictyate tot de puberteit. Daarentegen begint spermatogenese bij puberteit en vordert in golven hele volwassen leven zonder arrestatie. De verschillen tussen mannelijke en vrouwelijke meiose benadrukt de noodzaak tot het ontwikkelen van methoden die specifiek naar de beoordeling van deze processen in oöcyten en spermatocyten worden verzorgd. Op dit moment afhankelijk beoordelen Meiotische progressie grotendeels van het gebruik van chromatine spreads3,4,5. Terwijl chromatine spreads nuttig zijn voor het bestuderen van Meiotische chromosomen, verzuimen om cellulaire integriteit, voorkomen van evaluatie van cellulaire structuren zoals spindel microtubuli, centrosomes, de nucleaire envelop en telomeer bijlagen te behouden. Wonen beeldvorming en op lange termijn kweken technieken hebben zeer geavanceerde ons begrip van vrouwelijke meiose; soortgelijke benaderingen te visualiseren de hele intact cel, zijn echter minder vaak geïmplementeerd voor de studie van de spermatogenese6,7. Om te visualiseren dynamische gebeurtenissen in de gehele mannelijke meiose, hebben we aangepast gevestigde zaadvormende squash technieken om te snel beoordelen de cytologische functies muis spermatocyten8,9te ontwikkelen. De hier beschreven methode onderhoudt de integriteit van de cel, de studie van meerdere cellulaire structuren inschakelen tijdens verschillende stadia van de spermatogenese.
Deze zaadvormende squash techniek is een benadering van de hele cel, die het mogelijk voor de beoordeling van cellulaire structuren via immunofluorescentie microscopie maakt. Gemeenschappelijke histologische benaderingen te visualiseren Meiotische progressie in mannelijke muizen zoals haematoxylin en eosine kleuring van paraffine ingesloten testes en immunefluorescentie labeling van cryosecties is voorzien van een breed overzicht van Meiotische progressie. Echter deze technieken niet om te zetten in afzonderlijke cellen voorzover nodig voor de gedetailleerde analyse van de gebeurtenissen die zich tijdens de meiose10,11. Alternatieve technieken om te visualiseren Meiotische processen is afhankelijk van de verstoring van de belangrijke chemiosmotic om de spermatocyte te isoleren en oplossen van kernmateriaal3,4,5. Deze chemische behandelingen een belemmering vormen voor de waarneming van celtypes dan primaire spermatocyten. Een recent beschreven methode door Namekawa de onderzoekgemeenschap voor het behoud van de nucleaire architectuur van geïsoleerde spermatocyten heeft ingeschakeld, maar vereist het gebruik van een cytospin en accessoires die niet mag beschikken sommige laboratoria4. In tegenstelling, vereist de zaadvormende squash techniek alleen apparatuur die over het algemeen standaard is in de meeste cel biologie laboratoria.
De zaadvormende squash hier beschreven methode kan worden gebruikt om de verschillende celtypen gevonden binnen de seminiferous zaadvormende, met inbegrip van de sertoli-cellen, spermatogonia, primaire en secundaire spermatocyten en spermatids te visualiseren. Door deze techniek te koppelen met de in de buurt van de synchrone eerste golf van de spermatogenese bij jonge muizen, is het mogelijk te krijgen verrijkt populaties in cellen als zij vooruitgang door middel van meiose12. Dit proces staat een gedetailleerde analyse van processen in de gehele spermatogenese, zoals vroege profase gebeurtenissen, de G2/MI en de metafase, anafase overgangen en spermiogenesis. Bovendien kunnen zaadvormende squash preparaten worden gebruikt om te visualiseren cytologische kenmerken van de chromosomen (b.v. interchromatid domeinen (ICDs) en kinetochoren) en centrosomes (centrioles en pericentriolar materiaal/matrices). De squash-methode kan gemakkelijk worden uitgevoerd in parallel met andere experimentele benaderingen, zoals chromatine spreads en eiwit extractie. Bovendien is deze techniek met succes gewijzigd om te storten van levende in cellen op dia’s voor directe visualisatie13.
De hier beschreven methode omvat een hele cel seminiferous zaadvormende squash techniek voor het analyseren van de overgang van G2/MI in wild-type C57BL/6J muizen. De cytologische kenmerken van primaire spermatocyten invoeren de eerste Meiotische klasse werden gevisualiseerd met immunofluorescentie microscopie te observeren de Meiotische spindel. Deze veelzijdige techniek kan eenvoudig worden aangepast om te visualiseren andere Meiotische etappes en de verschillende soorten cellen. De techniek is ook vatbaar voor alternatieve visualisatie strategieën, zoals DNA en RNA vis benaderingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Muizen hebben bewezen als een nuttig model-organisme voor het bestuderen van de cellulaire gebeurtenissen waaraan Meiotische progressie tijdens de spermatogenese. Verder is het noodzakelijk om instrumenten catered aan de studie van de spermatogenese omdat vele evenementen, zoals afmonsteren Meiotische profase I te ontwikkelen, zijn seksueel dimorphic. Dit protocol beschrijft een methode squash seminiferous zaadvormende voor visualisatie en studie van de verschillende stadia van muis spermatogenese. Deze methode behoudt c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door NIGMS (R01GM11755) naar P.W.J. en door een opleiding subsidie fellowship van het National Cancer Institute (NIH) (CA009110) S.R.W. en J.H.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
Referências
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Morelli, M. A., Cohen, P. E. Not all germ cells are created equal: Aspects of sexual dimorphism in mammalian meiosis. Reproduction. 130 (6), 761-781 (2005).
- Sun, F., Handel, M. A. Regulation of the meiotic prophase I to metaphase I transition in mouse spermatocytes. Chromosoma. 117 (5), 471-485 (2008).
- Namekawa, S. H. Slide preparation method to preserve three-dimensional chromatin architecture of testicular germ cells. J Vis Exp. (83), e50819 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Galdon, G., Atala, A., Sadri-Ardekani, H. In vitro spermatogenesis: how far from clinical application?. Curr Urol Rep. 17 (7), (2016).
- Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. J Androl. 22 (6), 911-926 (2001).
- Page, J., Suja, J. A., Santos, J. L., Rufas, J. S. Squash procedure for protein immunolocalization in meiotic cells. Chromosome Res. 6 (8), 639-642 (1998).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Xu, X., Xu, P. A modified cryosection method for mouse testis tissue. Tissue Cell. 33 (2), 208-210 (2001).
- Hess, R., Moore, B. Histological methods for evaluation of the testis. Methods Toxicol. 3 (Pt A), 52-85 (1993).
- Bellvé, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Mol Biol Cell. 14 (July), 2768-2780 (2003).
- Bellvé, A. R., et al. Dissociation of the mouse testis and characterization of isolated spermatogenic cells. J Histochem Cytochem. 25 (7), 480-494 (1977).
- Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: an update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
- Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, pairing, and synapsis of homologs during meiosis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (6), 1-26 (2015).
- Hunter, N. Meiotic recombination: the essence of heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (12), 1-36 (2015).
- Scherthan, H., et al. Centromere and telomere movements during early meiotic prophase of mouse and man are associated with the onset of pairing. J Cell Biol. 134 (5), 1109-1125 (1996).
- Zickler, D., Kleckner, N. The leptotene-zygotene transition of meiosis. Annu Rev Genet. 32, 619-697 (1998).
- Scherthan, H. A bouquet makes ends meet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (8), 621-627 (2001).
- Turner, J. Meiotic sex chromosome inactivation. Development. 134 (10), 1823-1831 (2007).
- Royo, H., et al. ATR acts stage specifically to regulate multiple aspects of mammalian meiotic silencing. Genes Dev. 27 (13), 1484-1494 (2013).
- Turner, J. M., et al. Silencing of unsynapsed meiotic chromosomes in the mouse. Nat Genet. 37 (1), 41-47 (2005).
- Marjanović, M., et al. CEP63 deficiency promotes p53-dependent microcephaly and reveals a role for the centrosome in meiotic recombination. Nat Commun. 6, 7676 (2016).
- Inanç, B., Dodson, H., Morrison, C. G. A Centrosome-autonomous signal that involves centriole disengagement permits centrosome duplication in G2 phase after DNA damage. Mol Biol Cell. 21, 3866-3877 (2010).
- Firat-Karalar, E. N., Sante, J., Elliott, S., Stearns, T. Proteomic analysis of mammalian sperm cells identifies new components of the centrosome. J Cell Sci. 127 (Pt 19), 4128-4133 (2014).
- Fukuda, N., et al. The transacting factor CBF-A/Hnrnpab binds to the A2RE/RTS element of protamine 2 mRNA and contributes to its translational regulation during mouse spermatogenesis. PLoS Genet. 9 (10), e1003858 (2013).
- Lahn, B. T., et al. Previously uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (13), 8707-8712 (2002).
- Mermoud, J. E., Tassin, A. M., Pehrson, J. R., Brockdorff, N. Centrosomal association of histone macroH2A1.2 in embryonic stem cells and somatic cells. Exp Cell Res. 268 (2), 245-251 (2001).
- Shanmugam, M., Hernandez, N. Mitotic functions for SNAP45, a subunit of the small nuclear RNA-activating protein complex SNAPc. J Biol Chem. 283 (21), 14845-14856 (2008).
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460 (7252), 278-282 (2009).
- Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nat Methods. 1 (3), 249-254 (2004).
- Amory, J. K., et al. Suppression of spermatogenesis by bisdichloroacetyldiamines is mediated by inhibition of testicular retinoic acid biosynthesis. J Androl. 32 (1), 111-119 (2011).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biol Reprod. 88 (2), 40 (2013).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Kluin, P. M., Kramer, M. F., Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. Int J Androl. 5 (3), 282-294 (1982).
- Rodriguez, I., Ody, C., Araki, K., Garcia, I., Vassalli, P. An early and massive wave of germinal cell apoptosis is required for the development of functional spermatogenesis. EMBO J. 16 (9), 2262-2270 (1997).
- Kangasniemi, M., et al. Modulation of basal and FSH dependent cyclic AMP production in rat seminiferous tubules staged by an improved transillumination technique. Anat Rec. 227 (1), 62-76 (1990).
- Martianov, I., et al. Late arrest of spermiogenesis and germ cell apoptosis in mice lacking the TBP-like TLF/TRF2 gene. Mol Cell. 7 (3), 509-515 (2001).
- Henriksén, K., Parvinen, M. Stage-specific apoptosis of male germ cells in the rat: Mechanisms of cell death studied by supravital squash preparations. Tissue Cell. 30 (6), 692-701 (1998).
