Una técnica de Squash del túbulo seminífero para el análisis citológico de la espermatogénesis mediante el modelo de ratón
Summary
El objetivo de esta técnica de squash del túbulo es rápidamente evaluar características citológicas de desarrollo espermatocitos de ratón mientras que preserva la integridad celular. Este método permite el estudio de todas las etapas de la espermatogénesis y puede implementarse fácilmente junto a otros enfoques biológicos bioquímicos y moleculares para el estudio de la meiosis de ratón.
Abstract
La progresión meiótica en los hombres es un proceso que requiere la acción concertada de una serie de eventos celulares altamente reguladas. Errores que ocurren durante la meiosis pueden conducir a la infertilidad, la pérdida del embarazo o defectos genéticos. Comenzando en el inicio de la pubertad y continúa a lo largo de la edad adulta, ondas continuas semisincrónico de espermatocitos sufren espermatogénesis y en última instancia forman espermatozoides haploides. La primera ola de espermatocitos de ratón en iniciación meiótica aparecen en día 10 post parto (dpp 10) y se liberan en el lumen de los túbulos seminíferos como espermatozoides maduros en dpp 35. Por lo tanto, es ventajoso utilizar ratones dentro de esta ventana de tiempo del desarrollo con el fin de obtener poblaciones altamente enriquecidas de interés. Análisis de etapas rara de la célula es más difícil en los ratones más viejos debido al aporte de las ondas espermatogénica sucesivas, que incrementan la diversidad de las poblaciones celulares dentro de los túbulos. El método descrito aquí es una técnica fácilmente implementada para la evaluación citológica de las células que se encuentran dentro de los túbulos seminíferos de ratones, incluyendo espermatogonios, espermatocitos y espermátides. La técnica de squash túbulo mantiene la integridad de las células germinales masculinas aisladas y permite la examinación de estructuras celulares que no se visualizan fácilmente con otras técnicas. Para demostrar las posibles aplicaciones de esta técnica de squash del túbulo, montaje del huso fue supervisada en espermatocitos progresar a través de la profase metafase de la transición (la transición G2/MI). Además, duplicación del centrosoma, inactivación del cromosoma de sexo meiótica (MSCI) y formación del cromosoma ramo fueron evaluados como ejemplos de las estructuras citológicas que pueden ser observadas con este método de squash del túbulo. Esta técnica puede utilizarse para localizar defectos específicos durante la espermatogénesis que son causados por mutación o perturbación exógena, y por lo tanto, contribuye a la comprensión molecular de la espermatogénesis.
Introduction
La meiosis es un evento celular complejo en el que una sola ronda de replicación del ADN es seguida por dos sucesivas rondas de división celular. Varios eventos de meiosis específicos deben coordinarse durante las etapas iniciales de la meiosis para la segregación cromosómica precisa. Estos eventos incluyen la terminación de la recombinación homóloga, la orientación de la hermana cinetocoros durante la primera división meiótica y la pérdida gradual de los complejos de cohesina para resolver quiasmas entre homólogos. Regulación precisa de estos procesos es necesario para mantener la fertilidad y prevenir eventos de protooncogenes del cromosoma que pueden llevar a trastornos del desarrollo genéticos y aborto espontáneo1.
Mientras que los eventos clave de la meiosis ocurren en hombres y mujeres, existen diferencias significativas temporales y mecanicistas entre espermatogénesis y ovogénesis2. Por ejemplo, durante la meiosis femenina, profase I se produce durante el desarrollo embrionario y las detenciones en la etapa de dictyate hasta pubertad. Por el contrario, espermatogénesis comienza en la pubertad y progresa en oleadas a lo largo de la vida adulta sin detención. Las diferencias entre la meiosis masculina y femenina destaca la necesidad de desarrollar métodos que son atendidos específicamente hacia la evaluación de estos procesos en espermatocitos y ovocitos. En la actualidad, evaluar la progresión meiótica en gran parte se basa en el uso de la cromatina se separa3,4,5. Mientras que se separa de la cromatina es útil para estudiar los cromosomas meiotic, logran preservar la integridad celular, impidiendo la evaluación de estructuras celulares como los microtúbulos del huso, centrosomas, la envoltura nuclear y los accesorios de telómeros. Imágenes en vivo y técnicas de cultivo a largo plazo han avanzado grandemente nuestra comprensión de la meiosis femenina; enfoques similares para visualizar toda la célula intacta, sin embargo, se ejecutan con menos frecuencia para el estudio de la espermatogénesis6,7. Para poder visualizar eventos dinámicos a lo largo de la meiosis masculina, nos hemos adaptado técnicas de squash túbulo establecidos para evaluar rápidamente las características citológicas de desarrollo ratón espermatocitos8,9. El método descrito aquí mantiene la integridad de la célula, lo que permite el estudio de múltiples estructuras celulares durante las diferentes etapas de la espermatogénesis.
Esta técnica de squash del túbulo es un acercamiento entero de la célula, que permite la evaluación de las estructuras celulares mediante microscopia de la inmunofluorescencia. Métodos histológicos comunes para visualizar la progresión meiótica en ratones machos como haematoxylin y eosina de testículos de embebido de parafina y etiquetado inmunofluorescente de cryosections permiten una amplia visión de la progresión meiótica. Sin embargo, estas técnicas no logran resolver las células en la medida necesaria para el análisis detallado de los eventos que ocurren durante la meiosis10,11. Técnicas alternativas para visualizar procesos de meiosis dependen quimioautótrofos significativa interrupción el espermatocito a aislar y fijar materiales nucleares3,4,5. Estos tratamientos químicos impiden la observación de tipos celulares distintos de espermatocitos primarios. Un método recientemente descrito por Namekawa ha permitido a la comunidad de investigación para preservar la arquitectura nuclear de espermatocitos aislados, pero requiere el uso de un cytospin y accesorios que no pueden ser fácilmente disponibles en algunos laboratorios4. En cambio, la técnica de squash del túbulo sólo requiere de equipo que es generalmente estándar en la mayoría de los laboratorios biología celular.
El método de squash túbulo descrito aquí puede utilizarse para visualizar los tipos de células diversas dentro del túbulo seminífero, incluyendo células de sertoli, espermatogonias, espermatocitos primarios y secundarios y espermátidas. Por esta técnica de acoplamiento con la primera ola cerca-síncrono de la espermatogénesis de ratones jóvenes, es posible obtener poblaciones enriquecidas de células espermatogénica a medida que avancen a través de meiosis12. Este proceso permite el análisis detallado de los procesos a lo largo de la espermatogénesis, como eventos tempranos de la profase y la metafase a anafase transiciones y espermiogénesis y G2/MI. Además, preparados de calabaza del túbulo pueden utilizarse para visualizar las características citológicas de los cromosomas (por ejemplo dominios interchromatid (ICDs) y cinetocoros) y centrosomas (centriolos y el material pericentriolar/matrices). El método de la calabaza se puede realizar fácilmente en paralelo con otras aproximaciones experimentales, tales como extensiones de la cromatina y extracción de proteínas. Además, esta técnica se ha modificado con éxito para depositar espermatogénica células vivas en las diapositivas para la visualización directa de13.
El método aquí descrito requiere una técnica de squash de túbulos seminíferos células enteras para analizar la transición G2/MI en ratones C57BL/6J de tipo salvaje. Las características citológicas de espermatocitos primarios entrando en la primera división meiótica se visualizaron con microscopia de la inmunofluorescencia para observar el huso meiótico. Esta versátil técnica puede modificarse fácilmente para visualizar otras etapas meióticas y diferentes tipos de células. La técnica también es susceptible a las estrategias de visualización alternativa, tales como ADN y ARN pescado enfoques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ratones han demostrado para ser un organismo modelo útil para estudiar los eventos celulares que gobiernan la progresión meiótica durante la espermatogénesis. Además, es necesario desarrollar herramientas independientes para el estudio de la espermatogénesis debido a muchos eventos, tales como salir de la profase meiótica I, presentan dimorfismo sexual. Este protocolo describe un método de squash del túbulo seminífero de visualización y estudio de las diferentes etapas de la espermatogénesis del ratón. Este …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIGMS (R01GM11755) a P.W.J. y por una beca de beca de capacitación desde el Instituto Nacional de cáncer (NIH) (CA009110) S.R.W. y J.H.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
| 10x PBS | Quality Biological | 119-069-161 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| Horse Serum | Sigma | H-1270 | |
| 35mm x 10mm Petri Dish, Sterile, non-treated | CellTreat | P886-229638 | |
| Poly-L-lysine coated glass slides | Sigma | P0425-72EA | |
| Liquid Blocker Pen | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
| Humid Box | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
| Wheaton Coplin Glass Staining Dish for 5 or 10 Slides | Fisher | 08-813E | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Microscope Cover Slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
| Clear Nail Polish | Amazon | N/A | |
| Microsopes | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
| Observer Z1 | Zeiss | 4109431007994000 | |
| Zeiss ZEN 2012 blue edition image software | Zeiss | ||
| ORCA-Flash 4.0 CMOS camera | Hamamatsu | ||
| Primary Antibodies | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse anti-SYCP3 | Santa Cruz | sc-74569 | 1 in 50 |
| Rabbit anti-SYCP3 | Fisher (Novus) | NB300-231 | 1 in 1000 |
| Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | 1 in 50 |
| Human anti-Centromere Protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | 1 in 100 |
| Mouse anti-alpha tubulin | Sigma | T9026 | 1 in 1000 |
| Mouse anti-AIM1 | BD Biosciences | 611082 | 1 in 200 |
| Mouse anti-γH2AX | Thermo Fisher | MA1-2022 | 1 in 500 |
| Mouse anti-CENT3 | Abnova | H00001070-M01 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-pericentrin | Abcam | ab4448 | 1 in 200 |
| Rabbit anti-REC8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | 1 in 1000 |
Referências
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