Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren
Summary
Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.
Abstract
Experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) ist ein gut geschätzt experimentellen Modell der autoimmunen peripheren demyelinisierenden Erkrankungen. EAN Krankheit wird induziert durch Immunisierung von Mäusen mit neurogenen Peptide, entzündlichen Angriff gegen Komponenten des peripheren Nervensystems (PNS) zu lenken. Die jüngsten Fortschritte konnten die Induktion von EAN in der relativ resistent C57BL/6-Maus-Linie mit Myelin Protein zero (P0)106-125 oder P0180-199 Peptide in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Pertussis-Toxin geliefert. Die Fähigkeit, EAN induzieren in den Stamm C57BL/6 ermöglicht den Einsatz der zahlreichen genetische Werkzeuge, die auf diesem Hintergrund Maus vorhanden und ermöglicht so das anspruchsvolle Studium der Pathogenese der Krankheit und Vernehmung der mechanistischen Wirkung neuer Therapeutika in Kombination mit transgene Ansätze. In der vorliegenden Studie zeigen wir einen einfachen Ansatz, um erfolgreich EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Wir skizzieren auch ein Protokoll für die Beurteilung der funktionellen Defizite, die in diesem Modell, begleitet von einer Reihe von neuropathologische Funktionen auftreten. Somit ist dieses Modell ein leistungsfähiges experimentellen Modell die Pathogenese der menschlichen peripheren demyelinisierenden Neuropathien zu studieren und die Wirksamkeit der möglichen Therapien zu bestimmen, die darauf abzielen, Myelin-Reparatur zu schützen gegen Nervenschäden in autoimmune Neuritis.
Introduction
Periphere Neuropathien kann entweder genetisch bedingt oder erworben, mit erworbenen Neuropathien haben entweder metabolische, ischämische, entzündliche oder giftige Fällungsmitteln. Diese Krankheiten sind auch sinnvoll als axonalen oder demyelinative Ursprungs eingestuft. Die häufigsten erworbenen demyelinisierenden periphere Neuropathien akuten entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (AIDP sind, auch bekannt als Guillain-Barré-Syndrom, GBS) und chronisch entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP)1, 2 , 3 , 4; Beide zeichnen sich pathogenetisch durch eine Autoimmunreaktion gegen die Myelinscheide, Demyelinisierung peripherer Nerven verursacht. Bei diesen Erkrankungen aktivierte T-Zellen der Blut-Nerven-Schranke und generieren eine Immunreaktion in der PNS. Aktivierung von Makrophagen innerhalb der Nerv dann verursacht Demyelinisierung entweder direkt über phagocytic Angriff, oder indirekt über freigesetzten Entzündungsmediatoren, was in klinischen Behinderungen wie Lähmungen und sensorische Dysfunktion5. Während demyelinated Axone die Fähigkeit behalten, Remyelinated nach Demyelinisierung, Remyelinisierung ist oft verzögert oder unvollständig, wodurch Anfälligkeit der nackten Axone zu irreversiblen Schäden, das ist die wesentliche Ursache für dauerhafte klinischen Behinderung. Derzeit wirksamsten Behandlungen sind immunmodulatorische, aber trotz ihrer Wirksamkeit in vielen Fällen die Erholung ist oft langsam und ~ 25 % der Patienten erleben residual funktionelle Defizite, die ihre Lebensqualität6deutlich zu reduzieren, 7.
EAN ist eine weit verbreitete Tiermodell der demyelinisierenden peripheren Neuropathie, der wertvolle Einblicke in die Pathogenese und ein Mittel zur Beurteilung neuartiger Therapeutika4zur Verfügung gestellt hat. Dieses Modell induziert werden kann in verschiedenen Arten wie Kaninchen, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen, und wird durch Immunisierung mit neurogenen Antigene induziert. Hängt jedoch letztlich die erfolgreiche EAN Induktion eine entsprechende Immunantwort für Krankheit auftreten. Angesichts der Arten (und inter-Arten/Stamm) Variationen in Funktion des Immunsystems, wurden mehrere Kombinationen von Antigenen und Hilfsstoffe entwickelt, um erfolgreich EAN induzieren. In Bezug auf murinen genetische Werkzeuge ist der C57BL/6 die am weitesten verbreitete; Das traditionelle P2 Protein Peptid 57-81 (P257-81), die Krankheit in der anfälligen SJL Maus Belastung8 führt ist jedoch nicht in der Lage zu unerlaubten Pathogenese, funktionelle Defizite in der C57BL/6-Belastung führen. Glücklicherweise, Sensibilisierung Paradigmen mit P0106-125 oder P0180-199 Peptide, geliefert in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Keuchhusten Toxin bewältigt diese Barriere, so dass genetische Spezialtools in genutzt werden die EAN Mausmodell.
Hier ist eine einfache Methode für die Induktion von EAN in den Mäusen C57BL/6 vorgestellt. Darüber hinaus erfolgt eine detaillierte Gesamtkonzept, um die funktionelle und neuropathologische Defizite, die mit der Krankheit assoziiert zu bewerten. Die P0180–199 Peptid9 wurde anstelle der P057-81 alternative10gewählt. Das P0180–199 Modell produzieren weniger schwere klinische Symptome im Vergleich zu den P057-81 alternative10beschrieben worden und dürfte daher die Einführung von potenziell zu widerstehen schädliche genetische Störungen, von chirurgischen Eingriffen (z. B. osmotischen Pumpe Implantation) erholen und Laufband Gangart Funktionsprüfung4zugänglich ist. Jedoch konnte das Laufband Gangart Funktionstests und histologischen Protokolle hier beschriebenen leicht angewendet werden, wenn die Krankheit in einer P057-81 induzierte Variante zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode um EAN verwendet P0180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen, so dass die Quantifizierung der wichtigsten neuropathologische und funktionelle Defizite bei Mäusen mit EAN induziert induzieren. DISTINCT zu dem hier beschriebenen EAN Induktion-Protokoll ist die Verwendung der Anästhesie während der Durchführung der Impfung-Injektionen. Die Verwendung von Isofluran-Narkose verbessert erheblich die Möglichkeit, sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des Inokulums an de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG ist NHMRC Peter Doherty und Multiplesklerose Forschung Australien (MSRA) frühe Karriere Fellow. JLF wird unterstützt durch eine MSRA Postdoctoral Fellowship. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Australian National Health und Medical Research Council (NHMRC) Projekt #APP1058647 gewähren, JX.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
Referências
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
