גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי
Summary
דו ח זה מתווה גישה פשוטה לזירוז בהצלחה ניסוי חיסון לדלקת בעצה (EAN) באמצעות חלבון המיאלין אפס פפטיד180-199 (P0) בשילוב עם אדג’וונט מלאה של פרוינד, הרעלן שעלת. אנו מציגים פרדיגמה מתוחכם המסוגל להעריך במדויק את היקף הגירעונות פונקציונלי, neuropathology המתרחשים EAN הזה.
Abstract
לדלקת בעצה חיסון ניסיוני (EAN) הוא מודל ניסיוני היטב להערכה של מחלות אוטואימוניות של המיאלין היקפיים. EAN מחלה הנגרמת על ידי immunizing עכברים עם פפטידים neurogenic לביים מתקפה דלקתיות כלפי מרכיבי מערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). התפתחויות אחרונות אפשרו את אינדוקציה של EAN בקו עמיד יחסית C57BL/6 העכבר באמצעות חלבון המיאלין אפס (P0)106-125 או פפטידים180-199 P0 יועבר. בתוך אדג’וונט בשילוב עם ההזרקה של הרעלן שעלת. היכולת לגרום EAN בנימה זו C57BL/6 מאפשר השימוש בכלים גנטיים רבים הקיימים על רקע זה העכבר, ובכך מאפשר חקר המחלה פתוגנזה מתוחכמים והחקירה של הפעולה מכניסטית של הרומן הרפוי ב בשילוב עם גישות מהונדס. במחקר זה, נדגים בגישה פשוטה לזירוז בהצלחה EAN באמצעות פפטיד180-199 P0 בעכברים C57BL/6. אנחנו גם חלוקה לרמות פרוטוקול להערכה של גירעונות פונקציונלי המתרחשות במודל זה, בליווי מגוון רחב של תכונות neuropathological. לפיכך, המודל הזה הוא מודל ניסיוני עוצמה ללמוד בפתוגנזה של האנושי מחלות עצבים היקפיים המיאלין, וכדי לקבוע את היעילות של טיפולים פוטנציאליים שואפים לקדם את תיקון המיאלין ולהגן מפני נזק עצבי אוטואימוניות לדלקת בעצה.
Introduction
מחלות עצבים היקפיים יכול להיות גנטי במקורם או הנרכש, עם נזקי רכשה שיש גם מטבולית, ischaemic, precipitants דלקתיות או רעילים. מחלות אלו מסווגים גם מועיל או עצב, או demyelinative במקורם. הנפוצות ביותר רכשה demyelinating מחלות עצבים היקפיים הם חריפה דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (AIDP, הידוע גם בשם תסמונת גיליאן, GBS) כרונית דלקתית Demyelinating פולינוירופתיה של (CIDP)1, 2 , 3 , 4; שניהם מאופיינים שאינן קשורות pathogenetically תגובה אוטואימונית נגד למעטפת מיאלין, גורם demyelination של העצבים ההיקפיים. במחלות אלה, תאי T מופעל לחצות את מחסום הדם העצבים וליצור תגובה חיסונית בתוך מערכת העצבים ההיקפית. הפעלה של מקרופאגים בתוך העצב ואז גורם demyelination או ישירות באמצעות התקפה phagocytic או בעקיפין באמצעות מופרשים מתווכים דלקתיים, והתוצאה היא מגבלה קליניים כגון שיתוק ובעיות תפקוד חושי5. ואילו האקסונים demyelinated לשמור על היכולת להיות remyelinated בעקבות demyelination, remyelination מתעכבת לעיתים קרובות או שלם, וכתוצאה מכך הרגישות של האקסונים עירום כדי נזק בלתי הפיך, שהיא הגורם הקבוע קליני נכות. כיום, הטיפולים היעילים ביותר הם immunomodulatory, אבל למרות היעילות שלהם, במקרים רבים ההתאוששות הוא לרוב איטי, ~ 25% מהחולים יחוו שיורית גירעונות פונקציונלי זה להפחית באופן משמעותי את איכות החיים שלהם6, 7.
EAN הוא מודל בעלי חיים בשימוש נרחב של demyelinating נוירופתיה אשר סיפקה תובנות לתוך פתוגנזה ואת אמצעי כדי להעריך את הרומן סוכני טיפולית4. מודל זה יכול להיגרם מינים שונים כגון ארנבות, חולדות, עכברים, שרקנים, הנגרמת על ידי חיסון עם אנטיגנים neurogenic. עם זאת, בסופו של דבר אינדוקציה EAN מוצלח תלוי תגובה חיסונית המתאים למחלה להתרחש. בהתחשב הווריאציות מינים (וגם בין-species/זן) בתפקוד המערכת החיסונית, צירופים מרובים של אנטיגנים וחיסונים adjuvants פותחו לזירוז בהצלחה EAN. מבחינת כלים גנטיים מאתר, C57BL/6 היא הנפוצה ביותר; עם זאת, פפטיד חלבון P2 מסורתי 57-81 (P257-81) זה גורם למחלה רגישים SJL העכבר זן8 אין אפשרות פתוגנזה איליקיט שמוביל לגירעונות פונקציונלי המתח C57BL/6. למרבה המזל, פרדיגמות רגישות עולה באמצעות P0106-125 או פפטידים180-199 P0, יועבר. בתוך אדג’וונט בשילוב עם ההזרקה של שעלת ניתן הרעלן להתגבר על מכשול זה הפעלת כלים גנטיים מתוחכמים להיות מנוצל מודל EAN מאתר.
כאן מוצגת שיטה פשוטה עבור אינדוקציה של EAN בעכברים C57BL/6. בנוסף, מסופק בגישה מפורט מקיף מאת בו יש להעריך את גירעונות neuropathological פונקציונלי הקשורים במחלה. פפטיד9 199 180–P0 נבחר העדפה P057-81 חלופי10. המודל199 P0180–שתיארנו לייצר סימנים קליניים חמורים פחות בהשוואה P057-81 אלטרנטיבית10ולכן נוטים לספוג את ההקדמה של פוטנציאל לפליטת גנטי ברישול, להתאושש הליכים כירורגיים (כגון משאבת osmotic השרשה), והוא נוטה הליכון בהליכה פונקציית בדיקת4. עם זאת, ההליכון הילוך תפקודי והפרוטוקולים היסטולוגית המתוארים כאן יכול בקלות להיות מיושם כשלמדתי המחלה ב- variant57-81 המושרה P0.
Protocol
Representative Results
Discussion
דו ח זה מתאר שיטה פשוטה כדי לגרום EAN באמצעות פפטיד180-199 P0 בעכברים C57BL/6, המאפשר כימות של גירעונות neuropathological ופונקציונליים מפתח בעכברים המושרה עם EAN. ברורים בפרוטוקול אינדוקציה EAN המתוארים כאן הוא השימוש של הרדמה תוך כדי ביצוע זריקות חיסון. השימוש איזופלוריין הרדמה משפר באופן משמעותי את ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DGG הוא NHMRC פטר דוהרטי, אוסטרליה מחקר טרשת (MSRA) בתחילת הקריירה עמית. JLF נתמך על ידי הבתר MSRA. עבודה זו נתמכה על ידי הבריאות הלאומיים האוסטרלי, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) פרויקט הענק #APP1058647 ל- JX.
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
Referências
- Newswanger, D. L., Warren, C. R. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 69 (10), 2405-2410 (2004).
- Ruiz, E., Ramalle-Gomara, E., Quinones, C., Martinez-Ochoa, E. Trends in Guillain-Barre syndrome mortality in Spain from 1999 to 2013. Int J Neurosci. 126 (11), 985-988 (2016).
- Walling, A. D., Dickson, G. Guillain-Barre syndrome. Am Fam Physician. 87 (3), 191-197 (2013).
- Gonsalvez, D. G., et al. A Functional and Neuropathological Testing Paradigm Reveals New Disability-Based Parameters and Histological Features for P0180-199-Induced Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice. J Neuropathol Exp Neurol. 76 (2), 89-100 (2017).
- Berg, B., et al. Guillain-Barre syndrome: pathogenesis, diagnosis, treatment and prognosis. Nat Rev Neurol. 10 (8), 469-482 (2014).
- Koller, H., Schroeter, M., Kieseier, B. C., Hartung, H. P. Chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy–update on pathogenesis, diagnostic criteria and therapy. Curr Opin Neurol. 18 (3), 273-278 (2005).
- Griffin, J. W., et al. Pathology of the motor-sensory axonal Guillain-Barre syndrome. Ann Neurol. 39 (1), 17-28 (1996).
- Taylor, W. A., Hughes, R. A. Experimental allergic neuritis induced in SJL mice by bovine P2. J Neuroimmunol. 8 (2-3), 153-157 (1985).
- Zou, L. P., et al. P0 protein peptide 180-199 together with pertussis toxin induces experimental autoimmune neuritis in resistant C57BL/6 mice. J Neurosci Res. 62 (5), 717-721 (2000).
- Miletic, H., et al. P0(106-125) is a neuritogenic epitope of the peripheral myelin protein P0 and induces autoimmune neuritis in C57BL/6 mice. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (1), 66-73 (2005).
- Hafer-Macko, C., et al. Acute motor axonal neuropathy: an antibody-mediated attack on axolemma. Ann Neurol. 40 (4), 635-644 (1996).
- Griffin, J. W., et al. Early nodal changes in the acute motor axonal neuropathy pattern of the Guillain-Barre syndrome. J Neurocytol. 25 (1), 33-51 (1996).
