機能と神経病理学的評価の c57bl/6 マウスの実験的自己免疫性視神経炎を誘導するための単純なアプローチ
Summary
このレポートは、Freund 完全アジュバント、百日咳毒素との組み合わせでゼロ (P0)180 199ペプチド ミエリン蛋白を用いた実験的自己免疫性炎 (EAN) を正常に誘導するために単純な方法をについて説明します。機能的障害とこの EAN の発生病理の程度を正確に評価することができる洗練されたパラダイムを提案します。
Abstract
実験的自己免疫性視神経炎 (EAN) は自己免疫性末梢脱髄性疾患の実験モデルの当然です。EAN 病による神経因性ペプチドを持つマウスを免疫末梢神経系 (PNS) のコンポーネントに向かって炎症性攻撃を指示します。最近の進歩は、ミエリン蛋白ゼロ (P0)106 125や P0180 199ペプチド百日咳毒素の注入と組み合わせる補助で配信を使用して比較的耐性の C57BL/6 マウス ラインで EAN の誘導を可能にしました。C57BL/6 株に EAN を誘導する能力により、このマウスの背景に存在する多数の遺伝的ツールの使用とように洗練された病因学とで治療のメカニズムのアクションの尋問形質との組み合わせ。本研究では、c57bl/6 マウスで P0180 199ペプチドを用いた EAN を正常に誘導する単純なアプローチを示しています。我々 はまた、このモデルでは、神経病理学的機能の配列を伴って発生する機能的障害の評価のためのプロトコルを概説します。したがって、このモデルは強力な実験的モデル人間の末梢脱髄性ニューロパチーの病態を研究し、目的を髄修復を促進し、自己免疫の神経損傷に対する保護潜在的な療法の有効性を判断炎。
Introduction
末梢神経障害は起源で遺伝的または後天的のいずれかをすることができます取得したニューロパシー、どちらの代謝、虚血、炎症、または有毒な沈殿を持ちます。これらの疾患も便利、軸索または起源の demyelinative のいずれかに分類されます。最も一般的な脱髄性末梢神経障害、急性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (AIDP、ギランバレー症候群、ギランバレー症候群とも呼ばれます) を取得し、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー (CIDP)1,2,3,4;両方は pathogenetically、末梢神経の脱髄を引き起こす、髄鞘に対する自己免疫反応によって特徴付けられます。これらの疾患における活性化 T 細胞は血液神経関門を通過し、PNS 内免疫反応を生成します。神経内マクロファージの活性化、貪食攻撃を介して直接、または麻痺など感覚機能障害5臨床的障害の結果分泌の炎症性メディエーターを介して間接的に脱髄を引き起こします。脱髄軸索は、remyelinated 次の脱髄をする能力を保持しながら検査がよく遅れているまたは恒久的な臨床の主な原因である不完全な不可逆的な損傷は、裸の軸索の感受性の結果障害者。現在、最も効果的な治療法は、免疫調節、しかし多くの場合その有効性にもかかわらず、回復はしばしば遅いと 〜 25% の患者は彼らの生活の質の6を大幅に削減残留の機能的障害を経験 7。
EAN は、貴重な洞察を病態と新規治療薬4を評価する手段を提供している末梢神経障害を脱髄の広く使用されている動物モデルです。このモデルは、種、ウサギなどに誘起することラット、マウス、モルモット、および神経因性抗原接種によって誘導されます。しかし、最終的に成功の EAN 誘導が発生する病気のための適切な免疫反応に依存します。免疫機能で種・種間・ひずみの変化を考えると、抗原とアジュバントの複数の組み合わせは、EAN を正常に誘導するために開発されています。マウスの遺伝学的ツールに関して C57BL/6 は最も広く使用されています。しかし、伝統的な P2 タンパク質ペプチド 57-81 (P257 81) SJL マウスひずみ8の影響を受けやすい病気の結果は、C57BL/6 株の機能障害につながる違法な病因にはできません。幸いにも、感作性パラダイム P0106 125または P0180 199ペプチドを使用して配信補助療法併用百日咳の注入と毒素に活用される高度な遺伝的ツールを有効にするこの障壁を克服することができます、EAN マウスモデル。
ここでは、簡便な c57bl/6 マウスに EAN の誘導が表示されます。さらに、病気に関連付けられている機能と神経病理学的赤字を評価する包括的な詳細なアプローチを提供しています。P0180–199ペプチド9は、P057 81代替10優先して選ばれました。P0180–199モデル P057 81代替10と比較して少ない重度の臨床症状を生成する記載されている、したがって潜在的の導入に耐えられる可能性は劇物の遺伝的摂動 (浸透圧ポンプ注入) などの手術から回復、トレッドミル歩行機能4のテストを受けやすいです。ただし、トレッドミル歩行機能検査と組織のプロトコルがここで説明した簡単に適用でした P057 81誘起変形の疾患を勉強しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このレポートでは、誘発 EAN c57bl/6 マウスで P0180 199ペプチドを用いた、EAN がマウスのキー神経病理学的および機能欠損の定量化を可能にする簡単な方法について説明します。ここで記述されている EAN 誘導プロトコルは予防接種の注射を実行しながら麻酔の使用異なるです。イソフルラン麻酔の使用は、接種量が最小限のエラーと、動物へのストレスを目的の場所に皮下に注射される…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
武神は NHMRC ピートドハーティと多発性硬化症研究オーストラリア (MSRA) 初期キャリアの仲間です。JLF は、MSRA ポスドク研究員プログラムによってサポートされます。この仕事に支えられたオーストラリアの国民健康と医学研究評議会 (NHMRC) プロジェクトは JX に #APP1058647 を与えます。
Materials
| C57BL/6, male, 6-8 weeks old | Australian Bioresources Cenre, WA, Australia | ||
| Pertussis toxin | List Biological Laboratories, Inc., CA, USA | #181 | |
| 0.1M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS) | Laboratories will have their own protocol. | ||
| Isoflurane | Pharmachem, QLD, Australia | Laboratories will have their own protocol for administration. | |
| P0180–199 peptide | Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN | P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S | |
| Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA) | Difco, MI, USA | #231141 | |
| Freund's complete adjuvant (FCA) | Difco, MI, USA | #263910 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | #15710 | Dilute to 4% PFA day of tissue collection. |
| 25% glutaraldheyde | ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia | #11-30-8 | Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation. |
| Sodium azide | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SL189 | Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v). |
| Sucrose | Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia | SA030 | Use at 30% (w/v). |
| Optimum cutting temperature (OCT) medium | Sakura Finetek, CA, USA | #4583 | |
| Normal donkey serum | Merck Millipore, MA, USA | #S30-100 | Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| Triton-X 100 | Sigma Aldrich, MI, USA | #90o2-31-1 | Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory. |
| rabbit anti-amyloid precursor protein (APP) | Invitrogen (Life Technologies), CA, USA | S12700 | Used at 1:400 or titrate in own lab. |
| rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr) | Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel | Used at 1:500 or titrate in own lab. | |
| Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies | Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA | Various | Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory. |
| Aqueous mounting solution | Dako (Agilent), CA, USA | #S3023 | Each laboratory will have their own preference. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.5 mL syringe with 301/2 g needles | BD | #326105 | |
| 23 g needles | BD | #305143 | |
| Red ink pad | Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet. | ||
| DigiGate apparatus (includes treadmill) | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| DigiGate Imaging System | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Stopwatch | Any timer may be used. | ||
| DigiGait 8 Software | eMouse Specifics Inc. Framingham, MA | ||
| Dissecting microscope | Zeiss | Any appropriate dissecting microscope may be used. | |
| Charged slides | Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd | SF41296SP | |
| Cyrostat | Leica | Any suitable cyrostat may be used. | |
| Perfusion equipment and dissecting instruments | Labs will have their own perfusion protoctols. | ||
| Opaque humified chamber | Labs may produce their own using an opaque plastic container. | ||
| PAP pene | GeneTex (USA) | Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section. | |
| Confocal microscope | Zeis LSM780 | Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used. | |
| FIJI/Image J | National Institues of Health | Available from www.fiji.sc |
Referências
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