Uma abordagem simples para induzir a neurite auto-imune Experimental em camundongos C57BL/6 para avaliações funcionais e neuropatológicas

Summary

Este relatório apresenta uma abordagem simples para induzir com êxito neurite auto-imune experimental (EAN) usando a proteína mielina zero peptídeo de_180-199 (P0) em combinação com adjuvante completo de Freund e coqueluche toxina. Apresentamos um paradigma sofisticado capaz de avaliar com precisão a extensão dos défices funcionais e neuropatologia que ocorrem neste EAN.

Abstract

Neurite auto-imune experimental (EAN) é um modelo experimental bem apreciado de doenças desmielinizantes periféricas auto-imune. Doença EAN é induzida pela imunizar ratos com peptídeos neurogênicos para dirigir um ataque inflamatório para componentes do sistema nervoso periférico (SNP). Avanços recentes permitiram a indução de EAN na linha de rato relativamente resistente C57BL/6 usando proteína mielina zero (P0)_106-125 ou P0_180-199 peptídeos entregue em adjuvante, combinado com a injeção de toxina de coqueluche. A capacidade de induzir a EAN de estirpe C57BL/6 permite a utilização das inúmeras ferramentas genéticas que existem sobre este fundo de rato e assim permite que o sofisticado estudo da patogênese da doença e interrogatório da ação mecanicista da novela terapêutica em combinação com abordagens transgénicas. Neste estudo, vamos demonstrar uma abordagem simples para induzir com êxito EAN usando o peptídeo de_180-199 P0 em camundongos C57BL/6. Também descrevem um protocolo para a avaliação dos défices funcionais que ocorrem neste modelo, acompanhado por um conjunto de características neuropatológicas. Assim, este modelo é um poderoso modelo experimental para estudar a patogênese das neuropatias desmielinizantes periféricas humanas e para determinar a eficácia de terapias potenciais que visam promover a reparação da mielina e proteger contra danos nos nervos em auto-imune neurite.

Introduction

Neuropatias periféricas podem ser genético na origem ou adquiridos, com neuropatias adquiridas tendo ou metabólica, isquêmica, inflamatórias ou tóxicas precipitants. Estas doenças são também útil classificadas como axonal ou demyelinative na origem. O mais comum adquirida desmielinizantes neuropatias periféricas são aguda desmielinizante Polineuropatia inflamatória (AIDP, também conhecida como síndrome de Guillain-Barré, GBS) e crônica inflamatória desmielinizante polineuropatia (PDIC)^{1, 2 , 3 , 4}; os dois pathogenetically são caracterizados....

Protocol

todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo Instituto de Florey de neurociência e Saúde Mental (centro do cérebro de Melbourne) Comitê de ética Animal e siga a australiana código de prática para o uso de animais para científico Fins.

1. indução de EAN

Nota: EAN pode ser induzido com sucesso em camundongos C57BL/6 do sexo masculino com idade entre 6-8 semanas. O protocolo de indução leva 9 dias no total. Dia 0 refere-se ao dia da primeira imunização. Para este protocolo, injeções foram realizadas sob anestesia (consulte a etapa abaixo 1.1.2).

1. Em dia -1:
   1. preparar....

Results

P0_180-199 peptídeo induzida EAN em pistas de camundongos C57BL/6 para uma doença monofásica com escore clínico início do post 6 dias primeira imunização (dpi) e a máxima pontuação severidade é observada de dpi 25 seguido por alguns clínicos placar melhoria de 40 dpi duração (Figura 1)^4,9. Em termos de função da marcha, os ratos começam a falhar logo em 6 dpi em uma simples tarefa em execuçã.......

Discussion

Este relatório descreve um método simples para induzir EAN usando o peptídeo de_180-199 P0 em camundongos C57BL/6, permitindo a quantificação dos principais défices neuropatológicas e funcionais em ratos induzidos com EAN. Distinto para o protocolo de indução de EAN descrito aqui é o uso de anestesia durante a realização das injecções de imunização. O uso de isoflurano anestesia realça extremamente a capacidade de assegurar que o volume total de inóculo é injetado por via subcutânea no local desejado com erro m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, macho, 6-8 semanas de idade	Australian Bioresources Cenre, WA, Austrália
toxinas convulsas	Biological Laboratories, Inc., CA, EUA#	181
0,1 M isotônico de camundongo fosfatado tamponado salino (MT-PBS)			Os laboratórios terão seu próprio protocolo.
Isoflurano	Pharmachem, QLD, Austrália		Os laboratórios terão seu próprio protocolo de administração.
P0180– 199 peptídeo	Wuxi Nordisk Biotech Co. Tenente SHG, CHN		P0180– 199, sequência S– S– K– R– G– R– Perguntas e respostas; T– P– V– L– Y– A– M– L– D– H– S– R– S
O calor matou Mycobacterium tuberculosis (cepa H37RA)	Difco, MI, EUA	#231141
Adjuvante completo de Freund (FCA)	Difco, MI, EUA#	263910
16% de paraformaldeído (PFA)Serviços de	microscopia eletrônica	#15710	Diluir a 4% de PFA no dia da coleta de tecido.
25% de glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Austrália	# 11-30-8	Diluir para 2,5% de glutaraldeído no dia da fixação.
Azida de sódio	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Austrália	SL189	Crie 10% (p / v) de estoque em 0,1 milhão de MT-PBS. Use a 0,03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Austrália	SA030	Uso a 30% (p / v).
Meio de temperatura de corte ideal (OCT)	Sakura Finetek, CA, EUA	#4583
Soro de burro normal	Merck Millipore, MA, EUA	#S30-100	Use como diluente de anticorpos a 10% (v/v) ou outra concentração determinada pelo próprio laboratório.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, EUA	#90o2-31-1	Uso em diluente de anticorpos a 0,3% (v/v) ou outra concentração determinada pelo próprio laboratório.
proteína precursora anti-amilóide de coelho (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, EUA	S12700	Usado a 1: 400 ou titulado em laboratório próprio.
proteína 1 associada à anti-contactina de coelho (Caspr)	Presente do Prof. Elior Peles, Instituto Wiezmann de Ciência, Israel		Usado a 1:500 ou titulado em laboratório próprio.
Anticorpos secundários conjugados Alexa Fluor apropriados	Sondas moleculares (Life Technologies), OR, EUA	Vários	Uso a 1:200 ou titulação em laboratório próprio. A escolha da espécie em que o anticorpo foi criado e a Alexa Fluor escolhida fica a critério de cada laboratório.
Solução de montagem aquosa	Dako (Agilent), CA, EUA		Cada laboratório terá sua própria preferência.
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Equipamento
Seringa de 0,5 mL com 301/2 g agulhas	BD	#326105
agulhas de 23 g	BD	#305143
		de tinta vermelha	Qualquer almofada de tinta vermelha ou corante alimentar vermelho pode ser usado para marcar os pés dos animais.
Aparelho DigiGate (inclui esteira)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Cronômetro			Qualquer cronômetro pode ser usado.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Microscópio de dissecação	Zeiss		Qualquer microscópio de dissecação apropriado pode ser usado.
Corrediças carregadas	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Qualquer cirostato adequado pode ser usado.
Equipamentos de perfusão e instrumentos			laboratórios terão seus próprios protoctols de perfusão.
		humificada opaca	Os laboratórios podem produzir seus próprios usando um recipiente de plástico opaco.
PAP pene	GeneTex (EUA)		Lápis de cera ou tensão superficial também podem ser usados para criar um poço ao redor da seção de tecido.
Microscópio confocal	Zeis LSM780		Qualquer microscópio confocal com linhas de laser apropriadas pode ser usado.
FIJI / Imagem J	Institutos Nacionais de Saúde		Disponível a partir de www.fiji.sc