Methoden om wijzigingen van de studie in inherente aggregatie van eiwitten met de leeftijd in Caenorhabditis elegans
Summary
Het doel van de methode die hier gepresenteerd is om te verkennen eiwit aggregatie tijdens normale veroudering in de model-organisme C. elegans. Het protocol is een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van de zeer slecht oplosbaar grote aggregaten die met de leeftijd vormen en om te bepalen welke gevolgen de veranderingen in proteostasis aggregatie van eiwitten.
Abstract
De prevalentie van neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer (AD) en de ziekte van Parkinson (PD), is in de laatste decennia gegroeid. Deze leeftijd-geassocieerde aandoeningen worden gekenmerkt door het verschijnen van eiwit-aggregaten met fibrillary structuur in de hersenen van deze patiënten. Precies de reden waarom normaal oplosbare eiwitten ondergaan blijft een aggregatie proces slecht begrepen. De ontdekking dat de aggregatie van eiwitten niet beperkt tot ziekteprocessen is en deel van het normale verouderingsproces schakelt alleen de studie van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, regelen zonder het gebruik van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten. Hier beschrijven we methoden te onderzoeken die inherent zijn aan eiwit aggregatie in Caenorhabditis elegans door complementaire benaderingen. Ten eerste, we onderzoeken hoe om te groeien van grote aantallen van leeftijd-gesynchroniseerde C. elegans om leeftijd dieren en presenteren we de biochemische procedures voor het isoleren van hoogst-onoplosbare-grote aggregaten. In combinatie met een gerichte genetische knockdown, is het mogelijk om te ontleden de rol van een gen van belang in de bevordering van of voorkomen van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie met behulp van een uitgebreide analyse met kwantitatieve massaspectrometrie of een kandidaat-gebaseerde analyse met antilichamen. Deze bevindingen worden vervolgens bevestigd door in vivo analyse met transgene dieren uiting van TL-gelabeld aggregatie-naar voren gebogen eiwitten. Deze methoden moeten helpen uitleggen waarom bepaalde eiwitten zijn gevoelig voor aggregaat met de leeftijd en uiteindelijk hoe deze eiwitten volledig functioneel te houden.
Introduction
Eiwit misfolding en aggregatie worden herkend als een stempel van verschillende neurodegeneratieve ziekten zoals AD, PD, Amyotrofische laterale sclerose (ALS), Frontotemporale dementie (FTD) en vele anderen. Bijvoorbeeld, α-synuclein assemblages in amyloïde fibrillen die zich ophopen als Lewy organen met name in de substantia nigra van PD-patiënten, terwijl in ALS patiënten TDP-43 of FUS misfold naar formulier cytoplasmatische aggregaten in degenererende motorische neuronen. In elk van deze neurodegeneratieve aandoeningen mislukken mechanismen onderhoud eiwit homeostase of proteostasis om te voorkomen dat de accumulatie van misfolded eiwitten, daarom leiden tot ziekte.
Proteostasis is van cruciaal belang om ervoor te zorgen de cellulaire functies en onder normale omstandigheden deze regulerende mechanismen strak controle over het tempo van de eiwitsynthese, vouwen en afbraak. Verschillende studies tonen aan dat met de vergrijzing, de mogelijkheid van vele cellen en organen voor het behoud van eiwit homeostase geleidelijk in het gedrang komt en de fysiologische verslechtering van de netwerken van de proteostasis met de leeftijd is een belangrijke verzwarende factor voor neurodegeneratieve ziekten (herzien in verwijzingen1,2,3). Het feit dat de controle van de kwaliteit van het eiwit en de cellulaire reactie op stress ongevouwen eiwitten in gevaar met de leeftijd komen suggereert dat eiwit misfolding en aggregatie zou een algemene gevolg van veroudering. Inderdaad, wij en anderen hebben aangetoond dat eiwitten aggregatie beperkt zich niet tot ziekte en in plaats daarvan deel van het proteoom zeer wasmiddel-onoplosbaar in leeftijd dieren4,5,6,7 wordt ,8,9,10. Rekentijd en in vivo onderzoek bleek dat deze fysiologische leeftijdsgebonden aggregaten lijken op ziekte aggregaten in verschillende aspecten5. De ontdekking van endogene, leeftijd-afhankelijke eiwitten aggregatie geeft ons de mogelijkheid om te ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die aggregatie van eiwitten, zonder gebruik te maken van ectopically uitgedrukt menselijke ziekte-geassocieerde eiwitten reguleren. Op dit moment bestaat slechts beperkte informatie over de regulering van de wijdverbreide eiwit oplosbaarheid en over de gevolgen van deze disregulatie voor de gezondheid van het organisme.
De nematode C. elegans is een van de meest uitgebreid bestudeerde modelorganismen in onderzoek veroudering en deze dieren hebben een relatief korte levensduur vele karakteristieke veroudering eigenschappen waargenomen in hogere organismen tonen. De effecten van veroudering op de oplosbaarheid van eiwitten zijn bestudeerd in C. elegans door sequentiële biochemische fractionering gebaseerd op differentiële oplosbaarheid, die veel gebruikt wordt om uit te pakken van ziekte aggregaten op het gebied van neurodegeneratie onderzoek11 . Door kwantitatieve massaspectrometrie, werden verscheidene honderden eiwitten tot aggregatie-naar voren gebogen in C. elegans in de afwezigheid van ziekte5getoond. Hier beschrijven we in detail het protocol om te groeien van grote aantallen wormen in vloeibare cultuur en de sequentiële winning isoleren geaggregeerde eiwitten voor kwantificering massaspectrometrie en analyse door westelijke vlek. Omdat misfolded en aggregatie-naar voren gebogen eiwitten zich in leeftijd ophopen C. elegans gonaden en maskers veranderingen in andere somatische weefsels5,12,13, gebruiken we een mutant gonaden-minder te richten de analyse op eiwit oplosbaarheid in niet-reproductieve weefsels. De methode gepresenteerd maakt de analyse van zeer onoplosbare, grote aggregaten die onoplosbaar in 0,5% SDS en Ingehuld door relatief lage centrifugaal snelheid. U kunt ook een minder strenge extractie-protocol verzamelen ook kleinere en meer oplosbare aggregaten is gepubliceerd elders10. Daarnaast beschrijven we de methode gebruikt om te beoordelen aggregatie in vivo de C. elegans.
Over het algemeen kunnen deze methoden in combinatie met RNA-interferentie (RNAi) de rol van een gen van belang bij het moduleren van leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie evalueren. Hiervoor beschrijven we de analyse van de fragmenten van jonge en oude wormen met en zonder knockdown van een specifieke proteïne van belang met behulp van RNAi. Deze methoden moeten een krachtig hulpmiddel om te bepalen welke onderdelen van het netwerk proteostasis reguleren eiwit oplosbaarheid. Verschillende interventies zoals verminderd insuline/insuline-achtige groei factor (IGF) 1 signalering (IIS) is gebleken dat C. elegans veroudering14dramatisch te vertragen. Levensduur trajecten veroorzaken vaak eiwit-kwaliteit controlemechanismen en dus deze trajecten kunnen worden actief beïnvloeden het tarief van aggregatie van eiwitten. Als voorbeeld tonen we verminderde inherente eiwit aggregatie in langlevende dieren op remming van het traject van IIS7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij rapporteren hier een methodologie te isoleren van hoogst-onoplosbaar eiwit-aggregaten van veroudering C. elegans onderworpen aan RNAi voor analyse van de Spectrometrie van de massa en het westelijke bevlekken. We laten zien dat verbetering van de proteostasis doordat IIS sterk leeftijd-afhankelijke proteïne aggregatie voorkomt. Door het selecteren van specifieke aggregatie-naar voren gebogen eiwitten aan overexpress in C. elegans, is het mogelijk om te ontleden verder de mechanismen modulerende i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door financiële middelen van de DZNE en een Marie Curie internationale reïntegratietoelage (322120 naar D.C.D.)
Materials
| Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
| Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
| Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
| Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
| 1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
| Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
| pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
| Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
| 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
| Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
| DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
| RNaseA | Promega | A7973 | solution |
| Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
| Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
| TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
| Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
| Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
| Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
| Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
| Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
| Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
| Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
| Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
| Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
| High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
| Software | |||
| Image analysis software | ImageJ | ||
| Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
| E.coli strain | |||
| OP50 | CGC | ||
| RNAi bacteria | |||
| L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
| C. elegans mutants | |||
| CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
| C. elegans transgenics | |||
| DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
| DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
Referências
- Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
- David, D. C. Aging and the aggregating proteome. Frontiers in genetics. 3, 247 (2012).
- Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
- Ayyadevara, S., et al. Age- and Hypertension-Associated Protein Aggregates in Mouse Heart Have Similar Proteomic Profiles. Hypertension. 67, 1006-1013 (2016).
- David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS biology. 8, 1000450 (2010).
- Demontis, F., Perrimon, N. FOXO/4E-BP signaling in Drosophila muscles regulates organism-wide proteostasis during aging. Cell. 143, 813-825 (2010).
- Lechler, M. C., et al. Reduced Insulin/IGF-1 Signaling Restores the Dynamic Properties of Key Stress Granule Proteins during Aging. Cell reports. 18, 454-467 (2017).
- Reis-Rodrigues, P., et al. Proteomic analysis of age-dependent changes in protein solubility identifies genes that modulate lifespan. Aging cell. 11, 120-127 (2012).
- Tanase, M., et al. Role of Carbonyl Modifications on Aging-Associated Protein Aggregation. Scientific reports. 6, 19311 (2016).
- Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging C. elegans. Cell. 161, 919-932 (2015).
- Lee, V. M., Wang, J., Trojanowski, J. Q. Purification of paired helical filament tau and normal tau from human brain tissue. Methods in enzymology. 309, 81-89 (1999).
- Goudeau, J., Aguilaniu, H. Carbonylated proteins are eliminated during reproduction in C. elegans. Aging cell. 9, 991-1003 (2010).
- Zimmerman, S. M., Hinkson, I. V., Elias, J. E., Kim, S. K. Reproductive Aging Drives Protein Accumulation in the Uterus and Limits Lifespan in C. elegans. PLoS genetics. 11, 1005725 (2015).
- Uno, M., Nishida, E. Lifespan-regulating genes in C. elegans. Npj Aging And Mechanisms Of Disease. 2, 16010 (2016).
- Sulston, J. H. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Maine, E. M. RNAi As a tool for understanding germline development in Caenorhabditis elegans: uses and cautions. Developmental biology. 239, 177-189 (2001).
- Rauniyar, N., Yates, J. R. Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics. Journal of proteome research. 13, 5293-5309 (2014).
- Brignull, H. R., Morley, J. F., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Modeling polyglutamine pathogenesis in C. elegans. Methods in enzymology. 412, 256-282 (2006).
- Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , 1-58 (2013).
- Brunquell, J., Bowers, P., Westerheide, S. D. Fluorodeoxyuridine enhances the heat shock response and decreases polyglutamine aggregation in an HSF-1-dependent manner in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 141, 1-4 (2014).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5, 759-769 (2013).
- Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset. PLoS One. 9, 85964 (2014).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Luo, S., Kleemann, G. A., Ashraf, J. M., Shaw, W. M., Murphy, C. T. TGF-beta and insulin signaling regulate reproductive aging via oocyte and germline quality maintenance. Cell. 143, 299-312 (2010).
- Andux, S., Ellis, R. E. Apoptosis maintains oocyte quality in aging Caenorhabditis elegans females. PLoS genetics. 4, 1000295 (2008).
- Vilchez, D., et al. RPN-6 determines C. elegans longevity under proteotoxic stress conditions. Nature. 489, 263-268 (2012).
- Ghazi, A., Henis-Korenblit, S., Kenyon, C. A transcription elongation factor that links signals from the reproductive system to lifespan extension in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 5, 1000639 (2009).
- Shemesh, N., Shai, N., Meshnik, L., Katalan, R., Ben-Zvi, A. Uncoupling the Trade-Off between Somatic Proteostasis and Reproduction in Caenorhabditis elegans Models of Polyglutamine Diseases. Front Mol Neurosci. 10, 101 (2017).
- Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529, 92-96 (2016).
- Kawarabayashi, T., et al. Age-dependent changes in brain, CSF, and plasma amyloid (beta) protein in the Tg2576 transgenic mouse model of Alzheimer’s disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 372-381 (2001).
- Kraemer, B. C., et al. Neurodegeneration and defective neurotransmission in a Caenorhabditis elegans model of tauopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 9980-9985 (2003).
