Målet med den metoden som presenteras här är att utforska protein aggregation under normalt åldrande i modell organismen C. elegans. Protokollet utgör ett kraftfullt verktyg att studera de mycket olösligt stora aggregat som bildar med åldern och att avgöra hur förändringar i proteostasis påverkar protein aggregering.
I de sista årtiondena, har förekomsten av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD) och Parkinsons sjukdom (PD), vuxit. Dessa ålder-associerade sjukdomar kännetecknas av uppkomsten av protein aggregat med fibrillary struktur i hjärnan hos dessa patienter. Exakt varför normalt lösliga proteiner genomgå en aggregering process är fortfarande dåligt förstådd. Upptäckten att protein aggregering är inte begränsat till sjukdomsprocesser och istället en del av den normala åldrandeprocessen möjliggör studier av molekylära och cellulära mekanismer som reglerar protein aggregering, utan att använda ectopically uttryckt mänskliga sjukdomsassocierade proteiner. Här beskriver vi metoder för att undersöka inneboende protein aggregation i Caenorhabditis elegans genom kompletterande strategier. Först undersöker vi hur man odlar stora mängder ålder-synkroniserad C. elegans att få äldre djur och vi presenterar de biokemiska förfarandena för att isolera mycket-olöslig-stora aggregat. I kombination med en riktad genetisk knockdown, är det möjligt att dissekera rollen av en gen av intresse att främja eller hindra åldersberoende protein aggregation genom att använda antingen en omfattande analys med kvantitativa masspektrometri eller en kandidat-baserad analys med antikroppar. Dessa resultat bekräftas sedan av i vivo analys med transgena djur uttrycker lysrör-taggade aggregation-benägen proteiner. Dessa metoder bör bidra till att klargöra varför vissa proteiner är benägna att aggregat med ålder och i slutändan hur man håller dessa proteiner fullt fungerande.
Protein Skellefteåsjukan och aggregering redovisas som ett kännetecken för flera neurodegenerativa sjukdomar som AD, PD, amyotrofisk lateralskleros (ALS), frontotemporal demens (FTD) och många andra. Till exempel, α-synuclein församlingar i amyloida fibriller som ackumuleras som Lewy förkroppsligar bestämt i den substantia nigraen av PD patienter, medan i ALS patienter TDP-43 eller FUS misfold form cytoplasmiska aggregat i degenererande motoriska nervceller. I varje av dessa neurodegenerativa sjukdomar misslyckas mekanismer för att upprätthålla protein homeostas eller proteostasis att förhindra ansamling av felveckning proteiner, följaktligen leder till sjukdom.
Proteostasis är avgörande för att säkerställa cellfunktioner och under normala förhållanden dessa reglerande mekanismer kontrollera tätt proteinsyntes, vikning och nedbrytning. Flera studier visar att med åldrande, många celler och organ förmåga att bevara protein homeostas äventyras gradvis och fysiologiska försämringen av de proteostasis nätverk med ålder är en viktig försvårande faktor för neurodegenerativa sjukdomar (ses i referenser1,2,3). Det faktum att protein kvalitetskontroll och cellulära svar på ovikta protein stress äventyras med ålder antyder att protein Skellefteåsjukan och aggregation kan vara en allmän följd av åldrande. Ja, vi och andra har visat att protein aggregering är inte begränsad till sjukdom och i stället en del av proteomet blir mycket tvättmedel-olöslig i äldre djur4,5,6,7 ,8,9,10. Beräkningsbiologi och i vivo analys visade att dessa fysiologiska åldersrelaterade aggregat liknar sjukdomen aggregat i flera aspekter5. Upptäckten av endogena, åldersberoende protein aggregering ger oss möjlighet att dissekera de molekylära och cellulära mekanismer som reglerar protein aggregering, utan att använda ectopically uttryckta mänskliga sjukdomsassocierade proteiner. För närvarande finns endast begränsad information om regleringen av utbredd protein olöslighet och om effekterna av detta dysreglering på hälsan hos organismen.
Den nematoder C. elegans är en av de mest omfattande studerade modellorganismerna i åldrande forskning som dessa djur har en relativt kort livslängd och visa många karaktäristiska åldrande funktioner hos högre organismer. Effekterna av åldrande på protein olöslighet har studerats i C. elegans av sekventiell biokemiska fraktionering baserat på differentiell löslighet, som ofta används för att extrahera sjukdom aggregat i neurodegeneration forskningsområdet11 . Av kvantitativa masspektrometri visades flera hundra proteiner att bli aggregation-benägen i C. elegans i avsaknad av sjukdom5. Här beskriver vi i detalj i protokollet för att växa stort antal maskar i flytande kultur och sekventiella extraktionen att isolera aggregerade proteiner för kvantifiering av masspektrometri och analys genom Western blot. Eftersom felveckning och aggregation-benägen proteiner ansamlas i åldern C. elegans gonader och masker förändringar i andra somatiska vävnader5,12,13, vi använder en gonad-mindre mutant för att fokusera analysen på protein olöslighet i icke-reproduktiva vävnader. Metoden presenteras möjliggör analys av mycket olösliga i stora aggregat som är olöslig i 0,5% SDS och pelleterat av relativt låg centrifugal hastighet. Alternativt, ett mindre stränga extraktion protokoll att samla också mindre och mer lösliga aggregat har varit publicerad någon annanstans10. Dessutom beskriver vi den metod som används för att bedöma aggregation i vivo i C. elegans.
Sammantaget kan dessa metoder i kombination med RNA-interferens (RNAi) utvärdera rollen av en gen av intresse för modulerande åldersberoende protein aggregering. För detta beskriver vi analysen av extrakt från unga och äldre maskar med och utan Nedslagning av ett specifikt protein av intresse med hjälp av RNAi. Dessa metoder bör vara ett kraftfullt verktyg för att avgöra vilka komponenter av proteostasis nätverket reglerar protein olöslighet. Flera interventioner såsom minskad insulin/insulin-liknande tillväxtfaktor (IGF) 1 signalering (IIS) har visat sig dramatiskt fördröja C. elegans åldrande14. Livslängd vägar inducera ofta protein-kvalitet kontrollmekanismer och således dessa vägar kan aktivt påverka andelen protein aggregering. Som ett exempel visar vi minskad inneboende protein aggregation i långlivade djur vid hämning av IIS väg7.
Här rapporterar vi en metod att isolera mycket olösliga protein aggregat från åldrande C. elegans utsätts för RNAi för analys av masspektrometri och Western blotting. Vi visar att förbättra proteostasis genom att minska IIS kraftigt förhindrar åldersberoende protein aggregering. Genom att välja specifika aggregation-benägen proteiner till överuttrycka i C. elegans, är det möjligt att dissekera ytterligare mekanismer modulerande inneboende protein aggregering.
…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av medel från DZNE och en Marie Curie-programmets internationella återintegreringsbidrag (322120 till D.C.D.)
Fernbach culture flask | Corning | 4425-2XL | Pyrex, Capacity 2,800 ml, with 3 baffle indents |
Membrane Screw Cap | Schott | 1088655 | GL45 |
Nutating Mixer | VWR | 444-0148 | |
Separatory funnel | Nalgene | 4300-1000 | Capacity 1,000 ml |
1 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Gray needle, 27 G x ½ ", 0.4 mm x 13 mm | BD Microlance 3 | 300635 | |
Membrane filters 0.025 µM | Millipore | VSWP04700 | |
pH strip | Machery-Nagel | 92110 | pH-Fix 0-14 |
Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | Complete Mini EDTA-free tablets |
Octoxynol-9 | Applichem | A1388 | Triton X-100 |
4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M1317 | |
Nonylphenylpolyethylenglycol | Applichem | A1694 | Nonidet P40 (NP40) |
DNaseI | Roche | 04716728001 | recombinant, RNase free |
RNaseA | Promega | A7973 | solution |
Total protein blot staining | Thermofisher | S11791 | Sypro Ruby protein blot stain |
Total protein gel staining | Thermofisher | S12001 | Sypro Ruby protein gel stain |
TCEP (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride) | Serva | 36970 | |
Iodoacetamide | Serva | 26710 | |
Ammoniumbicarbonate | Sigma-Aldrich | 09830 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
Isobaric tags for relative and absolute quantitation | Sciex | 4352135 | iTRAQ Reagents Multiplex Kit |
Centrifuge Avanti J-26XP | Beckmann Coulter | 393126 | |
Ultracentrifuge Optima Max-XP | Beckmann Coulter | 393315 | |
Centrifuge 5424R | Eppendorf | 5404000413 | |
Centrifuge 5702 | Eppendorf | 5702000329 | |
Centrifuge Megafuge 40R | Thermo Scientific | 75004518 | |
Concentrator Plus | Eppendorf | 5305000304 | Centrifugal evaporator |
Fluorescent stereo-microscope M165 FC | Leica | With Planapo 2.0x objective | |
Dissection microscope | Leica | Leica S6E | |
High magnification microscope Zeiss Axio Observer Z1 | Zeiss | With PlanAPOCHROMAT 20x objective and Zeiss Axio Cam MRm | |
Software | |||
Image analysis software | ImageJ | ||
Analysis of mass spectrometry data | Protein Prospector | http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm | |
E.coli strain | |||
OP50 | CGC | ||
RNAi bacteria | |||
L4440 | Julie Ahringer RNAi library | ||
C. elegans mutants | |||
CF2253 | CGC, strain name: EJ1158 | Genotype: gon-2(q388) | |
C. elegans transgenics | |||
DCD214 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |
DCD215 | Della David's lab at DZNE Tübingen | Genotype: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::pab-1] | |