Dette manuskript beskriver en protokol til at isolere og kultur osteoklaster in vitro- fra mus knoglemarven og studere rollen til pattedyr/mekanistiske målet på rapamycin komplekse 1 i osteoklast dannelse.
Osteoklaster er unikke ben-resorbing celler, der adskiller fra knoglemarven monocyt/makrofag slægt. Dysfunktion af osteoklasterne kan resultere i en serie af knogle metaboliske sygdomme, herunder osteoporose. For at udvikle farmaceutiske mål for forebyggelse af patologiske masse knogletab, skal de mekanismer, hvorved osteoklaster differentiere fra prækursorer forstås. Evnen til at isolere og kultur et stort antal af osteoklasterne i vitro er kritisk for at fastslå rollen af specifikke gener i osteoklast differentiering. Inaktivering af pattedyr/mekanistiske målet på rapamycin komplekse 1 (TORC1) i osteoklaster kan mindske osteoklast antallet og øge knoglemasse; men de underliggende mekanismer kræver yderligere undersøgelse. I den foreliggende undersøgelse, er en RANKL-baseret protokol til at isolere og kultur osteoklaster fra mus knoglemarven og studere påvirkning af mTORC1 inaktivering på osteoklast dannelse beskrevet. Denne protokol resulterede med held i en lang række gigantiske osteoklaster, typisk inden for en uge. Sletning af Raptor nedsat osteoklast dannelse og nedsat aktivitet af sekretoriske tartrat-resistente sur fosfatase, der angiver, at mTORC1 er afgørende for osteoklast dannelse.
Bone er en skiftende orgel og er ombygget af osteoblaster og osteoklaster hele livet. Osteoklaster er ansvarlig for mineraliseret matrix resorption og osteoblaster syntetiserer og udskiller ny knogle matricer1. Balance mellem knogleresorption og knogledannelse er afgørende for knogle sundhed herunder vedligeholdelse af knogle masse og respons på stimulation og skade. Hvis denne balance forstyrres, kan en serie af metaboliske knoglesygdomme forekomme, herunder osteoporose og parodontale sygdomme. I disse sygdomme overstiger knogle masse tab som følge af osteoclastic knogleresorption knogledannende kapacitet af osteoblaster2,3. For at udvikle farmaceutiske mål for at behandle skelet lidelser, såsom osteoporose, er det således afgørende at forstå generation og biologi af osteoklasterne4.
Osteoklaster er unikke giant multinucleated celler beliggende på eller i nærheden af knoglen overfladen, og tilhører monocyt/makrofag familien1. Ibbotson K. J. et al. rapporteret en metode til at generere osteoklast-lignende celler in vitro- med medium indeholdende 1,25-dihydroxy-vitamin D35. Identifikation af makrofag koloni stimulerende faktor (M-CSF) og receptor aktivator for nuklear factor-κ B ligand (RANKL) som afgørende faktorer for osteoklast dannelse har dramatisk øget effektivitet af osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. muligheden for at kultur osteoklaster in vitro- har forbedret vores forståelse af generation og regulering af osteoklasterne.
Pattedyr/mekanistiske målet på rapamycin (mTOR) funktioner i to strukturelt og funktionelt adskilte komplekser, nemlig mTORC1 og mTORC28,9. De to multi protein komplekser er adskilt fra hinanden på grund af deres forskellige komponenter og downstream substrater. mTORC1 indeholder den unikke regulerende forbundet protein af mTOR (Raptor), mens mTORC2 indeholder rapamycin-ufølsom følgesvend mTOR (Rictor)9. mTORC1 kan integrere og sender vigtige signaler til regulerer cellevækst, spredning og differentiering. For nylig, viste vi, at mTORC1 spiller en central rolle i netværket af kataboliske knogleresorption ved sletning af Raptor til at inaktivere mTORC1 i osteoklaster10. Men de underliggende mekanismer kræver yderligere undersøgelse. I den foreliggende undersøgelse, blev en RANKL-baserede osteoclastogenic metode brugt til at generere osteoklaster fra knoglemarv-afledte makrofager (BMMs) af wild-type (WT) og RapCtsk mus og studere påvirkning af mTORC1 inaktivering på osteoklast dannelse.
Osteoclastogenic analyse er den mest udbredte metode til at isolere og kultur osteoklaster in vitro-12,13. Mens flere RANKL-baserede osteoklast induktioner har været beskrevet13,14,15, beskrevet den nuværende undersøgelse en protokol med nogle ændringer baseret på de tidligere metoder.
I den tidligere undersøgelse, BMMs plating …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke Dr. Minghan Tong og S. Kato for venligt leverer reagenser og mus. Vi takke medlemmerne af Zou lab til nyttige diskussioner. Dette arbejde blev støttet i en del af tilskud fra 973 Program fra det kinesiske ministerium for videnskab og teknologi (mest) [2014CB964704 og 2015CB964503], klinisk forskningsprogram af 9 People’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Tak for hjælpen af Core facilitet for cellebiologi og Core facilitet i kemisk biologi, CAS Center for ekspertise inden for Molekylær celle videnskab, Shanghai Institut for biokemi og cellebiologi, kinesiske Academy of Sciences.
Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
Glutamine | Gibico | 25030081 | |
Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
IX71 | Olympus | ||
Envision | Perkin Elmer | ||
0.45-mm Syringe | |||
Scissor | |||
Mosquito forcep |