En RANKL-baserade Osteoclast kultur analys av mus benmärgen att undersöka betydelsen av mTORC1 Osteoclast bildandet
Summary
Detta manuskript beskriver ett protokoll till isolat och kultur osteoklaster i vitro från mus benmärg, och att studera rollen däggdjur/mekanistiska målet på rapamycin komplexa 1 i osteoclast formation.
Abstract
Osteoklaster är unika ben-resorbing celler som skiljer från benmärgen monocyt/makrofag släktlinje. Dysfunktion av osteoklaster kan resultera i en serie av metaboliska skelettsjukdomar, inklusive osteoporos. För att utveckla farmaceutiska mål för förebyggande av patologiska massa benförlust, måste de mekanismer genom vilka osteoklaster skilja från prekursorer förstås. Möjligheten att isolera och kultur ett stort antal osteoklaster i vitro är avgörande för att fastställa specifika gener hos osteoklasterna differentieringen i roll. Inaktivering av däggdjur/mekanistiska målet för rapamycin komplexa 1 (TORC1) i osteoklaster kan minska osteoclast nummer och öka benmassan; de bakomliggande mekanismerna kräver dock ytterligare studier. I den aktuella studien beskrivs ett RANKL-baserat protokoll att isolera och kultur osteoklaster från mus benmärg och att studera påverkan av mTORC1 inaktivering på osteoclast bildas. Detta protokoll resulterade framgångsrikt i ett stort antal giant osteoklaster, vanligtvis inom en vecka. Radering av Raptor nedsatt osteoclast bildandet och minskade aktiviteten av sekretoriska tartrat-resistenta syra fosfatas, som anger att mTORC1 är kritiska för osteoclast bildandet.
Introduction
Ben är ett ständigt organ och är ombyggda av osteoblaster och osteoklaster under hela livet. Osteoklaster är ansvarig för mineraliserade matrix resorption och osteoblaster syntetisera och utsöndra nya ben matriser1. Balansen mellan benresorption och benbildning är avgörande för benhälsa inklusive underhåll av ben massa och svar på stimulering och skada. Om denna balans störs, kan det uppstå en rad metabola bensjukdomar, inklusive osteoporos och parodontala sjukdomar. I dessa sjukdomar överskrider massa benförlust som följd osteoklastisk benresorption de ben som bildar kapacitet av osteoblaster2,3. Således, för att utveckla farmaceutiska mål för behandling av skelettsjukdomar som osteoporos, är det viktigt att förstå generation och biologi av osteoklaster4.
Osteoklaster är unika Multinucleära jätteceller ligger på eller nära benytan och tillhör monocyt/makrofag familj1. Ibbotson K. J. et al. rapporterade en metod för att generera osteoclast-liknande celler in vitro- med mediet som innehåller 1,25-dihydroxi-vitamin D35. Identifiering av makrofag-koloni stimulerande faktor (M-CSF) och receptor activator för nuclear factor-κ B ligand (RANKL) som viktiga faktorer av osteoclast bildande har dramatiskt ökat effektiviteten i osteoclastogenesis in vitro 1 , 6 , 7. möjlighet att kultur osteoklaster i vitro har förbättrat vår förståelse av generationen och reglering av osteoklaster.
Däggdjur/mekanistiska målet av rapamycin (mTOR) funktioner i två strukturellt och funktionellt distinkta komplex, nämligen mTORC1 och mTORC28,9. De två multi proteinkomplex är skilda från varandra på grund av deras olika komponenter och nedströms substrat. mTORC1 innehåller unik föreskrivande-associerade proteinet av mTOR (Raptor), medan mTORC2 innehåller okänsliga för rapamycin följet av mTOR (Rictor)9. mTORC1 kan integrera och överföra viktiga signaler som reglerar celltillväxt, proliferation och differentiering. Nyligen har visat vi att mTORC1 spelar en nyckelroll i nätverket av katabola benresorption genom borttagande av Raptor att inaktivera mTORC1 i osteoklaster10. De bakomliggande mekanismerna kräver dock ytterligare studier. I den aktuella studien användes en RANKL-baserade osteoclastogenic metod för att generera osteoklaster från benmärgen-derived makrofager (BMMs) av vildtyp (WT) och RapCtsk möss och att studera påverkan av mTORC1 inaktivering på hos osteoklasterna bildning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Osteoclastogenic analysen är den mest använda metoden för att isolera och kultur osteoklaster in vitro-12,13. Medan flera RANKL-baserade osteoclast induktioner har varit beskrivs13,14,15, beskrivs föreliggande studie ett protokoll med några ändringar baserat på föregående metoder.
I den tidigare studien BMMs plätering omedel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. Minghan Tong och S. Kato för vänligt ge reagenser och möss. Vi tacka medlemmarna i Zou lab för användbar diskussioner. Detta arbete var stöds delvis genom bidrag från 973 Program från den kinesiska ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta) [2014CB964704 och 2015CB964503], kliniska forskningsprogrammet 9 Peoples Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Tack för hjälp av Core faciliteten för Cellbiologi och Core facilitet för kemisk biologi, CAS Center for Excellence i molekylär Cell vetenskap, Shanghai Institute of biokemi och cellbiologi, kinesiska vetenskapsakademin.
Materials
| Raptorfl/fl mice | The Jackson Laboratory | 013188 | |
| Ctsk-cre mice | a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan | ||
| α-MEM | Corning | 10-022-CVR | |
| Glutamine | Gibico | 25030081 | |
| Penicillin streptomycin | Gibico | 15140122 | |
| Fetal calf serum | BioInd | 04-001-1A | |
| Recombinant mouse M-CSF protein | R&D | Q3U4F9 | |
| Recombinant mouse RANKL protein | R&D | Q3TWY5 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime | C3702 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | 302643 | |
| Acetone | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
| Formaldehyde solution | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | |
| Fast Garnet GBC Base solution | Sigma-Aldrich | 3872 | |
| Sodium Nitrite Solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
| Naphthol AS-BI Phosphate Solution | Sigma-Aldrich | 3871 | |
| Acetate solution | Sigma-Aldrich | 3863 | |
| Tartrate solution | Sigma-Aldrich | 3873 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | Corning | 21-031-CVR | |
| L-tartaric acid | Sigma-Aldrich | 251380 | |
| Sodium tartrate dibasic dehydrate | Sigma-Aldrich | s4797 | |
| Glycine | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| MgCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| ZnCl2 | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| NaOH | Shanghai Chemical Co. Ltd. | ||
| Phosphatase substrate | Sigma-Aldrich | P4744 | |
| anti-Raptor | Cell Signaling Technology | 2280 | |
| anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236) | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| anti-ribosomal protein S6 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| anti-β-actin | Santa Cruz Biotechnology | sc-130300 | |
| 37% formaldehyde | Xilong scientific | ||
| polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane | Bio-Rad | ||
| Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Millipore | 00000367MSDS | |
| IX71 | Olympus | ||
| Envision | Perkin Elmer | ||
| 0.45-mm Syringe | |||
| Scissor | |||
| Mosquito forcep |
Referências
- Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. Osteoclast differentiation and activation. Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).
- Jaenisch, R., Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nature Genetics. 33, 245-254 (2003).
- Feng, X., McDonald, J. M. Disorders of bone remodeling. Annu Rev Pathol. 6, 121-145 (2011).
- Boyce, B. F. Advances in osteoclast biology reveal potential new drug targets and new roles for osteoclasts. J Bone Miner Res. 28 (4), 711-722 (2013).
- Ibbotson, K. J., Roodman, G. D., McManus, L. M., Mundy, G. R. Identification and characterization of osteoclast-like cells and their progenitors in cultures of feline marrow mononuclear cells. J Cell Biol. 99 (2), 471-480 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93 (2), 165-176 (1998).
- Wong, B. R., et al. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-Jun N-terminal kinase in T cells. J Biol Chem. 272 (40), 25190-25194 (1997).
- Zoncu, R., Efeyan, A., Sabatini, D. M. mTOR: from growth signal integration to cancer, diabetes and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (1), 21-35 (2011).
- Bhaskar, P. T., Hay, N. The two TORCs and Akt. Dev Cell. 12 (4), 487-502 (2007).
- Dai, Q., et al. Inactivation of Regulatory-associated Protein of mTOR (Raptor)/Mammalian Target of Rapamycin Complex 1 (mTORC1) Signaling in Osteoclasts Increases Bone Mass by Inhibiting Osteoclast Differentiation in Mice. J Biol Chem. 292 (1), 196-204 (2017).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH Protoc. 2008, (2008).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Tevlin, R., et al. Osteoclast derivation from mouse bone marrow. J Vis Exp. (93), e52056 (2014).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-based osteoclastogenic assays from murine bone marrow cells. Methods Mol Biol. 1130, 307-313 (2014).
- Hsu, H., et al. Tumor necrosis factor receptor family member RANK mediates osteoclast differentiation and activation induced by osteoprotegerin ligand. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (7), 3540-3545 (1999).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast?. J Pathol. 144 (4), 225-226 (1984).
- Wein, M. N., et al. Control of bone resorption in mice by Schnurri-3. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (21), 8173-8178 (2012).
