En matrise-basert sammenlignende Genomic hybridisering plattform for effektiv påvisning av kopi nummer variasjoner i rask Neutron-indusert Medicago truncatula mutanter
Summary
Denne protokollen gir eksperimentell trinn og informasjon om reagenser, utstyr og verktøy for forskere som er interessert i å utføre hele genomet matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) analyse av kopi nummer variasjoner i planter.
Abstract
Mutanter er uvurderlig genetiske ressurser for gen funksjon studier. Vil generere mutant samlinger, utnyttes tre typer mutagener, inkludert biologisk som T-DNA eller transposon, kjemiske som ethyl methanesulfonate (EMS) eller fysisk som ionisering stråling. Typen mutasjon observert varierer avhengig av mutagen brukes. For ionisering stråling indusert mutanter inkluderer mutasjoner sletting, kopiering eller omorganisering. Mens T-DNA eller transposon-baserte mutagenese er begrenset til arter som er utsatt for transformasjon, kan kjemisk eller fysisk mutagenese brukes til en rekke arter. Imidlertid er karakterisering av mutasjoner avledet fra kjemiske eller fysisk mutagenese tradisjonelt avhengig av en kart-basert kloning tilnærming som er arbeidsintensiv og tidkrevende. Her viser vi at en høy tetthet genomet matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (aCGH) plattform kan brukes for å effektivt oppdage og karakterisere kopi nummer variasjoner (CNVs) i mutanter avledet fra rask neutron bombardement (FNB) mutagenese i Medicago truncatula, Belgfrukt art. Hele genomet sekvens analyse viser at det er mer enn 50 000 gener eller genet modeller i M. truncatula. I dag, Soccer-indusert mutanter i M. truncatula er avledet fra mer enn 150.000 M1 linjer, som representerer uvurderlig genetiske ressurser for funksjonell studier av gener i genomet. Den aCGH plattformen beskrevet her er et effektivt verktøy for å karakterisere FNB-indusert mutanter i M. truncatula.
Introduction
Belgfrukter (Fabaceae) er den tredje største planter, med mange økonomisk viktigste arter som soyabønner (Glycine max) og alfalfa (Medicago sativa). Belgfrukt-planter kan samhandle med nitrogen-innfesting jord bakterier, vanligvis kalt Rhizobia å utvikle rot knuter der den stemningsfulle dinitrogen er redusert til ammoniakk for bruk av næringsplanten. Som sådan, dyrking av Belgfrukt avlinger krever litt input av nitrogen gjødsel og dermed bidrar til bærekraftig jordbruk. Belgfrukt avlinger produsere blader og frø med høye proteininnhold, serverer utmerket grovfôr og korn avlinger. Men har dyrket Belgfrukt arter generelt komplekse genomet strukturer, gjør funksjonelle studier av gener som spiller nøkkelroller i Belgfrukt-spesifikke prosesser tungvint. Medicago truncatula er allment vedtatt som modell Art for Belgfrukt studier hovedsakelig fordi (1) det har et diploide genom relativt liten haploid genomet størrelse (~ 550 Mbp); (2) planter kan forvandles stabilt for genet funksjonelle studier; og (3) det er nært knyttet til alfalfa (M. sativa), dronningen av forages og mange andre økonomisk viktigste avlinger for translational studier. Nylig det Genova orden M. truncatula cv Jemalong A17 har vært utgitt1,2. Merknad i genomet viser at det er mer enn 50.000 spådd gener eller genet modeller i genomet. For å bestemme funksjonen av de fleste av genene i M. truncatula er genom en utfordrende oppgave. For å lette funksjonelle studier av gener, en omfattende samling av mutanter mellom over 150 000 M1 linjene er generert ved hjelp av rask neutron bombardement (FNB) mutagenese i M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Rask neutron, en høy energi ionisering mutagen, har vært brukt i generere mutanter i mange plantearter inkludert Arabidopsis5,6, ris (Oryza sativa)7, tomat (Solanum lycopersicum), soyabønner (Glycine soja; G. max)8,9, bygg (Hordeum vulgare) og Lotus japonicus10. En stor del av mutasjoner avledet fra FNB mutagenese leies DNA slettinger som varierer i størrelse fra noen base parene til mega base parene9,11. Mange fenotypen-assosiert gener har blitt identifisert og preget4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. tidligere molekylær kloning av underliggende gener fra FNB mutanter lettelse opp på en kart-basert tilnærming som er tidkrevende og begrenser antall mutanter å være preget på molekylært nivå. Nylig flere gratis tilnærminger inkludert transkripsjon-baserte metoder, genomet flislegging matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) for DNA kopi nummer variant gjenkjenning og hele genomet sekvensering, har vært ansatt å lette den karakteristikk av sletting mutanter i ulike organismer inkludert dyr og planter20,21,22,23,24,25, 26,,27,,28,,29,,30,,31.
For å lette karakterisering av FNB mutanter i M. truncatula, en hel-genome matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) er plattform utviklet og godkjent. Som rapportert i dyr systemer, tillater matrise-basert CGH plattformen påvisning av kopi nummer variasjoner (CNVs) på hele genomet nivå i M. truncatula FNB mutanter. Videre lesjoner kan bekreftes av PCR og sletting grenser kan identifiseres ved sekvensering. Samlet er matrise CGH plattformen effektive for identifisere lesjoner i M. truncatula FNB mutanter. Her, er matrise CGH framgangsmåten og PCR karakteristikk av sletting grenser i en M. truncatula FNB mutant illustrert.
Følgende protokollen gir eksperimentell trinn og informasjon om reagenser, utstyr og verktøy for forskere som er interessert i å utføre hele genomet matrise-basert sammenlignende genomisk hybridisering (CGH) analyse av antall kopier variasjoner i planter. Som et eksempel, ble Medicago truncatula FN6191 mutant brukt til å identifisere sletting regioner og kandidat gener tilknyttet mutant fenotyper. M. truncatula FN6191 mutant, opprinnelig isolert fra en rask neutron bombardement-indusert sletting mutant samling32 (se Tabell for materiale), viste en hyper-nodulation fenotypen etter vaksinering med jord bakterie, Sihorhizobium meliloti Sm1021, i motsetning til vill type planter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utviklet en matrise-basert CGH plattform av karakteristikk av rask Nøytron-bombardement (FNB)-indusert mutanter i M. truncatula cv. Jemalong A17. For å demonstrere bruk av matrisen CGH metoden oppdage genet mutasjoner, utført vi aCGH analyse av muterte FN6191, som viste en hyper-nodulation fenotypen i motsetning til vill type planter, når inokulert med S. meliloti Sm1021. For segmentering analyse, ble et segment ansett betydelig hvis loggen2 forholdet mener av sonder i segmentet va…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering av dette arbeidet tilbys i en del av en bevilgning fra NSF anlegget Genome Research (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
Referências
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genética. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
