Uma plataforma array de hibridização genômica comparativa para detecção eficiente de variações no número de cópias em Medicago truncatula mutantes induzidos por nêutrons rápidos
Summary
Este protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para pesquisadores interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro das variações números de cópia em plantas.
Abstract
Os mutantes são inestimáveis recursos genéticos para estudos de função do gene. Para gerar conjuntos de mutante, três tipos de agentes mutagénicos podem ser utilizados, incluindo biológicos tais como o T-DNA ou transposon, produto químico como Metanossulfonato de etila (EMS), ou físico, como a radiação de ionização. O tipo de mutação observada varia de acordo com o mutagênico utilizado. Para ionização radiação induzida por mutantes, mutações incluem a exclusão, a duplicação ou rearranjo. Enquanto T-DNA ou mutagénese transposon-baseado é limitado a espécies que são suscetíveis a transformação, mutagênese química ou física pode ser aplicado a uma ampla gama de espécies. No entanto, a caracterização das mutações derivadas de mutagênese química ou física tradicionalmente baseia-se numa abordagem de clonagem baseados no mapa, que é a mão de obra intensiva e demorado. Aqui, nós mostramos que uma plataforma de hibridação genômica comparativa baseada em array (protocolo) do genoma de alta densidade pode ser aplicada para eficientemente detectar e caracterizar cópia números variações (CNVs) em mutantes derivados de mutagênese de bombardeio (FNB) de neutrões rápidos em Medicago truncatula, uma espécie de vegetal. Análise de sequências do genoma inteiro mostra que existem mais de 50.000 genes ou modelos de gene em M. truncatula. No presentes, induzida pelo FNB mutantes em M. truncatula são derivadas de mais de 150.000 linhas M1, representando inestimáveis recursos genéticos para estudos funcionais de genes no genoma. A plataforma de protocolo descrita aqui é uma ferramenta eficiente para caracterizar os mutantes FNB-induzida em M. truncatula.
Introduction
Leguminosas (Fabaceae) são a terceira maior família de plantas, com muitas espécies economicamente importantes, tais como a soja (Glycine max) e alfafa (Medicago sativa). Os legumes podem interagir com bactérias fixadoras de nitrogênio solo, geralmente chamado de Rhizobia desenvolver nódulos de raiz no qual o dinitrogênio atmosférico é reduzido a amônia para uso pela planta hospedeira. Como tal, o cultivo de culturas de vegetal requer pouca entrada de fertilizantes nitrogenados e, portanto, contribui para uma agricultura sustentável. Culturas de vegetal produzem folhas e sementes com conteúdo de alta proteína, servindo como forragem excelente e colheitas de grão. No entanto, a espécie vegetal cultivada geralmente têm estruturas complexas do genoma, fazendo estudos funcionais de genes que desempenham papéis-chave em processos específicos de vegetal pesados. Medicago truncatula foi adotado extensamente como uma espécie de modelo para estudos de vegetal principalmente porque (1) ele possui um genoma diploide com um tamanho relativamente pequeno genoma haploide (~ 550 Mbp); (2) plantas estàvel transformam-se para estudos funcionais do gene; e (3) que está intimamente relacionado com alfafa (M. sativa), a rainha das forragens e muitas outras culturas economicamente importantes para estudos de translação. Recentemente, a sequência do genoma de M. truncatula cv Jemalong A17 tem sido lançado1,2. Anotação do genoma mostra que existem mais de 50.000 genes previstos ou modelos de gene no genoma. Para determinar a função da maioria dos genes do M. truncatula genoma é uma tarefa desafiadora. Para facilitar estudos funcionais de genes, uma coleção abrangente de mutantes no intervalo de mais de 150.000 M1 linhas foi gerada usando o mutagenesis de bombardeio (FNB) nêutrons rápidos em M. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Nêutron rápido, um agente mutagénico ionização de alta energia, tem sido usado na geração de mutantes em muitas espécies de plantas, incluindo Arabidopsis5,6, arroz (Oryza sativa)7, tomate (Solanum lycopersicum), soja (Glycine soja; G. máx)8,9, cevada (Hordeum vulgare) e Lotus japonicus10. Uma grande parte das mutações derivadas de mutagénese FNB são devido a exclusões de DNA que variam em tamanho de alguns pares de bases a mega pares de base9,11. Muitos genes associados fenótipo foram com êxito identificado e caracterizado4,12,13,14,15,16, 17 , 18 , 19. anteriormente, clonagem molecular dos genes subjacentes de mutantes FNB baseou-se em uma abordagem baseada em mapa, que é demorado e limita o número de mutantes para ser caracterizada a nível molecular. Recentemente, várias abordagens complementares, incluindo métodos baseados em transcrição, genoma telhar hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) para detecção de variação número do DNA cópia e sequenciamento do genoma inteiro, têm sido empregada para facilitar o caracterização de mutantes de exclusão em diversos organismos, incluindo animais e plantas20,21,22,23,24,25, 26,,27,28,29,30,31.
Para facilitar a caracterização de mutantes FNB em M. truncatula, uma todo-genoma baseada em array genômica hibridação comparativa (CGH) plataforma foi desenvolvida e validada. Conforme relatado em sistemas de animais, a plataforma CGH baseada em array permite a detecção de variações de número de cópia (CNVs) ao nível do genoma inteiro em mutantes M. truncatula FNB. Além disso, as lesões podem ser confirmadas por PCR e fronteiras de exclusão podem ser identificadas por sequenciamento. Em geral, a plataforma CGH matriz é uma ferramenta eficiente e eficaz na identificação de lesões em mutantes de M. truncatula FNB. Aqui, o procedimento CGH matriz e caracterização de PCR das fronteiras de exclusão em um mutante FNB M. truncatula são ilustrados.
O seguinte protocolo fornece etapas experimentais e informações sobre os reagentes, equipamentos e ferramentas de análise para os investigadores que estão interessados na realização de análise de hibridação genômica comparativa baseada em array (CGH) do genoma inteiro do número de cópia variações nas plantas. Como exemplo, Medicago truncatula FN6191 mutante foi usado para identificar regiões de exclusão e associados com fenótipos mutantes de genes candidatos. M. truncatula FN6191 mutante, originalmente isolada de um neutrão rápido exclusão induzida por bombardeio mutante coleção32 (ver Tabela de materiais), exibiu um fenótipo de hipernodulação após a inoculação com o solo bactéria, tem Sihorhizobium Sm1021, em contraste com as plantas do tipo selvagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós desenvolvemos uma plataforma CGH baseada em array para a detecção e caracterização de bombardeamento de neutrões rápidos (FNB)-induzido mutantes em M. truncatula CV Jemalong A17. Para demonstrar o uso da matriz método CGH na detecção de mutações genéticas, realizamos análise de protocolo do mutante FN6191, que exibiu um fenótipo de hipernodulação em contraste com plantas de tipo selvagem, quando inoculados com S. tem Sm1021. Para a análise de segmentação, um segmento foi consider…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financiamento deste trabalho é fornecido em parte por uma concessão do NSF planta Genome Research (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
Referências
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genética. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
