На основе массива сравнительной геномной гибридизации платформа для эффективного обнаружения копии номер вариации в быстро нейтрон-индуцированной Люцерна truncatula мутантов
Summary
Этот протокол обеспечивает экспериментальные шаги и информацию о реагентов, оборудования и инструменты анализа для исследователей, которые заинтересованы в проведении анализа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (CGH) всего генома копировать количество вариаций в растения.
Abstract
Мутантов являются бесценным генетических ресурсов для исследования функции гена. Для создания коллекции мутантов, могут использоваться три типа мутагенов, включая биологических например T-ДНК или transposon, химическая как этиловый метансульфонат (EMS) или физической например ИИИ. Тип мутации наблюдается варьируется в зависимости от мутаген используется. Для ионизации индуцированного излучения мутантов мутации включают, удаления, дублирования или перегруппировки. В то время как T-ДНК или на основе transposon мутагенеза ограничен видов, которые восприимчивы к трансформации, химические или физические мутагенеза может применяться к широкому спектру видов. Однако характеристика мутаций, производный от химических или физических мутагенеза традиционно опирается на карта на основе клонирования подход, который является труд интенсивной и много времени. Здесь мы покажем, что платформа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (aCGH) с высокой плотностью генома может применяться к эффективно обнаруживать и определять характеристики копии номер вариаций (CNVs) в мутантов, производный от быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ) мутагенеза в Truncatula Люцерна, бобовых видов. Весь геном последовательности анализ показывает, что существует более чем 50 000 генов или гена модели в . м. truncatula. В настоящее время, ФНБ индуцированной мутантов в . м. truncatula являются производными от более чем 150.000 линий M1, представляют собой бесценный генетические ресурсы для функциональных исследований генов в геноме. Платформа aCGH, описанные здесь является эффективным инструментом для характеризующие FNB-индуцированной мутантов в . м. truncatula.
Introduction
Бобовые (Fabaceae) — третий по величине семейство цветковых растений, с много экономически важных видов, таких как сои (Glycine max) и Люцерна (Medicago sativa). Бобовых растений может взаимодействовать с азотфиксирующих бактерий почвы, как правило, называют Rhizobia для разработки корневого узелки, в которых атмосферного азота уменьшено до аммиака для использования растения-хозяина. Таким образом выращивания бобовых культур требует мало ввода азотных удобрений и таким образом способствует устойчивому развитию сельского хозяйства. Бобовых производства, листья и семена с высоким содержанием белка, служит отличным кормом и зерновых культур. Однако культивируемых бобовых видов, как правило, имеют сложные генома структур, делая функциональные исследования генов, которые играют ключевую роль в бобовых конкретных процессов громоздким. Люцерна truncatula была широко принята в качестве модели видов бобовых исследований главным образом потому, что (1) он имеет диплоидный генома с размером относительно небольшой гаплоидным геномом (~ 550 Mbp); (2) растения могут быть стабильно преобразованы для функциональных исследований ген; и (3) она тесно связана с люцерны (м. sativa), королева кормов и многих других экономически важных культур для трансляционного исследования. Недавно, последовательность генома truncatula м. резюме Jemalong A17 был выпущен1,2. Аннотация генома показывает, что существует более чем 50000 предсказал генов или модели генов в геноме. Чтобы определить функцию большинства генов в . м. truncatula геном является сложной задачей. Чтобы облегчить функциональные исследования генов, всеобъемлющей коллекции мутантов в диапазоне свыше 150000 M1 линии был сгенерирован с помощью быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ) мутагенеза в . м. truncatula cv Jemalong A173 ,4. Быстрых нейтронов, высокой энергии ионизации мутаген, был использован в генерации мутантов в многих видов растений, включая Arabidopsis5,6,7риса (Oryza sativa), помидоры (Solanum lycopersicum), сои (Glycine сои; G. Макс)8,9, ячменя (Hordeum vulgare) и Lotus japonicus10. Большая часть мутаций, производный от мутагенеза FNB обусловлены ДНК удаления этого диапазона размером от нескольких пар до мега низкопробных пар9,11. Многие связанные с фенотипом гены были успешно выявлены и охарактеризованы4,12,13,14,,1516, 17 , 18 , 19. ранее, молекулярное клонирование базового генов от мутантов FNB полагались на карта на основе подхода, который отнимает много времени и ограничивает количество мутантов, чтобы охарактеризовать на молекулярном уровне. Недавно, несколько бесплатные подходов, включая методы, основанные на стенограмму, геном, черепица на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (CGH) ДНК копии номер варианта обнаружения и всего генома, были использованы для облегчения характеристика удаления мутантов в различных организмах, включая животных и растений20,21,,2223,24,25, 26,27,28,,2930,31.
Для облегчения характеризации FNB мутантов в . м. truncatula, всего геном на основе массива сравнительной геномной гибридизации (CGH) платформа разработана и проверены. Как сообщалось в животных систем, на основе массива CGH платформа позволяет обнаружение копировать количество вариаций (CNVs) на уровне всего генома в . м. truncatula FNB мутантов. Кроме того поражения может быть подтверждена ПЦР и удаление границ могут быть идентифицированы по виртуализации. В целом платформа CGH массив является эффективным и действенным инструментом выявления поражений в . м. truncatula FNB мутантов. Здесь проиллюстрированы массив CGH процедуры и ПЦР характеристика удаления границ в мутанта FNB м. truncatula .
Следующий протокол обеспечивает экспериментальные шаги и информацию о реагентов, оборудования и инструменты анализа для исследователей, которые заинтересованы в проведении анализа на основе массива Сравнительная геномная гибридизация (CGH) всего генома копия числа вариации в растениях. В качестве примера Люцерна truncatula FN6191 мутант была использована для выявления удаления регионов и кандидат генов, связанных с мутант фенотипов. М. truncatula FN6191 мутант, первоначально изолирован от быстрых нейтронах бомбардировки индуцированной удаления мутант коллекции32 (см. Таблицу материалы), выставлены гипер узелки фенотип после прививки с почвой бактерия, Sihorhizobium meliloti Sm1021, в отличие от дикого типа растений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы разработали платформу на основе массива CGH для обнаружения и определения характеристик быстрых нейтронах бомбардировки (ФНБ)-индуцированной мутантов в . м. truncatula cv. Jemalong A17. Чтобы продемонстрировать использование массива CGH метод выявления мутаций гена, мы провели анализ aCGH мута?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование этой деятельности обеспечивается частично грант от исследования генома растений NSF (IOS-1127155).
Materials
| Medicago truncatula genome array, 1 x 1 M | Agilent | G4123A | |
| Medicago truncatula FN6191 (mutant) | In house | FN6191 | |
| Medicago truncatula Jemalong A17 (reference) | In house | A17 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | 1000D | |
| SureTag DNA Labeling Kit | Agilent | 5190-3400 | |
| Random primer | Agilent | 5190-3399 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-1L | |
| Thermocycler | MJ research | PTC-200 | |
| Centrifuge | Labnet international Inc | Spectrafuge 24D | |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | 5185-5979 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | 5188-5380 | |
| Hybridization Chamber gasket slides | Agilent | G2505 | |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | 5190-3393 | |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and 2 | Agilent | 5188-5221 | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | G2534A | |
| Hybridization oven | Agilent | G2545A | |
| Purification Columns | Agilent | 5190-3391 | |
| Laser scanner | Roche | MS200 | |
| NimbleScan 2.6 | Roche Nimblegen | 5225035001 | |
| Signal Map 1.9 | Roche Nimblegen | Signalmap1.9 |
Referências
- Tang, H., et al. An improved genome release (version Mt4.0) for the model legume Medicago truncatula. BMC Genomics. 15, 312 (2014).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
- Wang, H., Li, G., Chen, R., da Silva, J. T. Fast neutron bombardment (FNB) induced deletion mutagenesis for forward and reverse genetic studies in plants. Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology: Advances and Topical Issues. , 629-639 (2006).
- Rogers, C., Wen, J., Chen, R., Oldroyd, G. Deletion-based reverse genetics in Medicago truncatula. Plant Physiol. 151 (3), 1077-1086 (2009).
- Alonso, J. M., et al. Five components of the ethylene-response pathway identified in a screen for weak ethylene-insensitive mutants in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (5), 2992-2997 (2003).
- Silverstone, A. L., Ciampaglio, C. N., Sun, T. The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway. Plant Cell. 10 (2), 155-169 (1998).
- Li, X., Lassner, M., Zhang, Y. Deleteagene: a fast neutron deletion mutagenesis-based gene knockout system for plants. Comp Funct Genomics. 3 (2), 158-160 (2002).
- Bolon, Y. T., et al. Phenotypic and genomic analyses of a fast neutron mutant population resource in soybean. Plant Physiol. 156 (1), 240-253 (2011).
- Men, A. E., et al. Fast Neutron Mutagenesis of Soybean (Glycine soja L.) Produces a Supernodulating Mutant Containing a Large Deletion in Linkage Group H. Genome Letters. 1 (3), 147-155 (2002).
- Hoffmann, D., Jiang, Q., Men, A., Kinkema, M., Gresshoff, P. M. Nodulation deficiency caused by fast neutron mutagenesis of the model legume Lotus japonicus. J Plant Physiol. 164 (4), 460-469 (2007).
- Li, X., et al. A fast neutron deletion mutagenesis-based reverse genetics system for plants. Plant J. 27 (3), 235-242 (2001).
- Bourcy, M., et al. Medicago truncatula DNF2 is a PI-PLC-XD-containing protein required for bacteroid persistence and prevention of nodule early senescence and defense-like reactions. New phytol. 197 (4), 1250-1261 (2013).
- Chen, J., et al. Control of dissected leaf morphology by a Cys(2)His(2) zinc finger transcription factor in the model legume Medicago truncatula. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (23), 10754-10759 (2010).
- Ge, L., et al. Increasing seed size and quality by manipulating BIG SEEDS1 in legume species. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), 12414-12419 (2016).
- Kalo, P., et al. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the GRAS family of transcriptional regulators. Science. 308 (5729), 1786-1789 (2005).
- Oldroyd, G. E., Long, S. R. Identification and characterization of nodulation-signaling pathway 2, a gene of Medicago truncatula involved in Nod actor signaling. Plant Physiol. 131 (3), 1027-1032 (2003).
- Peng, J., et al. Regulation of compound leaf development in Medicago truncatula by fused compound leaf1, a class M KNOX gene. Plant Cell. 23 (11), 3929-3943 (2011).
- Tsujimoto, Y., et al. Arabidopsis TOBAMOVIRUS MULTIPLICATION (TOM) 2 locus encodes a transmembrane protein that interacts with TOM1. EMBO J. 22 (2), 335-343 (2003).
- Wang, D., et al. A nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science. 327 (5969), 1126-1129 (2010).
- Bejjani, B. A., Shaffer, L. G. Application of array-based comparative genomic hybridization to clinical diagnostics. J Mol Diagn. 8 (5), 528-533 (2006).
- Emerson, J. J., Cardoso-Moreira, M., Borevitz, J. O., Long, M. Natural selection shapes genome-wide patterns of copy-number polymorphism in Drosophila melanogaster. Science. 320 (5883), 1629-1631 (2008).
- Gong, J. M., et al. Microarray-based rapid cloning of an ion accumulation deletion mutant in Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (43), 15404-15409 (2004).
- Guryev, V., et al. Distribution and functional impact of DNA copy number variation in the rat. Nat Genet. 40 (5), 538-545 (2008).
- Haun, W. J., et al. The composition and origins of genomic variation among individuals of the soybean reference cultivar Williams 82. Plant Physiol. 155 (2), 645-655 (2011).
- Infante, J. J., Dombek, K. M., Rebordinos, L., Cantoral, J. M., Young, E. T. Genome-wide amplifications caused by chromosomal rearrangements play a major role in the adaptive evolution of natural yeast. Genética. 165 (4), 1745-1759 (2003).
- Jones, M. R., Maydan, J. S., Flibotte, S., Moerman, D. G., Baillie, D. L. Oligonucleotide Array Comparative Genomic Hybridization (oaCGH) based characterization of genetic deficiencies as an aid to gene mapping in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 8, 402 (2007).
- Lakshmi, B., et al. Mouse genomic representational oligonucleotide microarray analysis: detection of copy number variations in normal and tumor specimens. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11234-11239 (2006).
- Mitra, R. M., et al. A Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase required for symbiotic nodule development: Gene identification by transcript-based cloning. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4701-4705 (2004).
- Rios, G., et al. Characterization of hemizygous deletions in citrus using array-comparative genomic hybridization and microsynteny comparisons with the poplar genome. BMC Genomics. 9, 381 (2008).
- Skvortsov, D., Abdueva, D., Stitzer, M. E., Finkel, S. E., Tavare, S. Using expression arrays for copy number detection: an example from E. coli. BMC Bioinformatics. 8, 203 (2007).
- Werner, J. D., et al. Quantitative trait locus mapping and DNA array hybridization identify an FLM deletion as a cause for natural flowering-time variation. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2460-2465 (2005).
- Xi, J., Chen, Y., Nakashima, J., Wang, S. M., Chen, R. Medicago truncatula esn1 defines a genetic locus involved in nodule senescence and symbiotic nitrogen fixation. Mol Plant Microbe Interact. 26 (8), 893-902 (2013).
- Schnabel, E., Journet, E. P., de Carvalho-Niebel, F., Duc, G., Frugoli, J. The Medicago truncatula SUNN gene encodes a CLV1-like leucine-rich repeat receptor kinase that regulates nodule number and root length. Plant Mol Biol. 58 (6), 809-822 (2005).
- Horvath, B., et al. Loss of the nodule-specific cysteine rich peptide, NCR169, abolishes symbiotic nitrogen fixation in the Medicago truncatula dnf7 mutant. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15232-15237 (2015).
- Kim, M., et al. An antimicrobial peptide essential for bacterial survival in the nitrogen-fixing symbiosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (49), 15238-15243 (2015).
- . Medicago truncatula Mutant Database Available from: https://medicago-mutant.noble.org/mutant/FNB.php (2017)
- Burton, R. SNP genotyping with the next generation of CGH microarray. MLO Med Lab Obs. 45 (7), (2013).
