हम सही isobaric लेबलिंग, व्यापक भिन्नीकरण, bioinformatics उपकरण, और एक उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए इंटरफेस के साथ संयोजन में गुणवत्ता नियंत्रण कदम के साथ प्रोटीन quantitate करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।
कई असाधारण अग्रिमों में किया गया है मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ms)-आधारित प्रोटियोमिक्, में विशेष तकनीकी प्रगति के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी (lc) मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री करने के लिए युग्मित (नियंत्रण रेखा एमएस/ms) और isobaric लेबलिंग division क्षमता. यहां, हम एक गहन प्रोटियोमिक् रूपरेखा प्रोटोकॉल है कि 10-plex मिलकर जन टैग (टीएमटी) एक व्यापक नियंत्रण रेखा के साथ लेबलिंग/एमएस/एमएस मंच, और पोस्ट-एमएस अभिकलनी हस्तक्षेप सुधार को सही quantitate पूरी proteomes को जोड़ती है । इस प्रोटोकॉल निंनलिखित मुख्य चरणों में शामिल हैं: प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन, टीएमटी लेबलिंग, 2 आयामी (2d) नियंत्रण रेखा, उच्च संकल्प जन स्पेक्ट्रोमेट्री, और गणना डेटा प्रोसेसिंग । गुणवत्ता नियंत्रण चरण समस्या निवारण और प्रयोगात्मक भिन्नता का मूल्यांकन करने के लिए शामिल किए गए हैं । स्तनधारी नमूनों में १०,००० से अधिक प्रोटीन इस प्रोटोकॉल के साथ आत्मविश्वास से quantitated हो सकते हैं । इस प्रोटोकॉल को मामूली बदलाव के साथ पोस्ट शोधों के संशोधनों के quantitation पर भी लागू किया जा सकता है । इस मल्टीप्लेक्स, मजबूत विधि जटिल नमूनों की एक किस्म में proteomic विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, सेल संस्कृति, पशु ऊतकों, और मानव नैदानिक नमूनों सहित.
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी में अग्रिम जैविक प्रणालियों और मानव रोग के अध्ययन के लिए एक नया परिदृश्य के लिए नेतृत्व किया है । इस जीनोम की माप की एक बड़ी संख्या की अनुमति दी है, transcriptome, proteome, metabolome, और अंय आणविक प्रणालियों मूर्त बनने के लिए । मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में सबसे संवेदनशील तरीकों में से एक है, और प्रोटियोमिक् में अपने आवेदन तेजी से मानव जीनोम के अनुक्रमण के बाद विस्तार किया गया है । प्रोटियोमिक् क्षेत्र में, पिछले कुछ वर्षों के एमएस-आधारित मात्रात्मक विश्लेषणों में प्रमुख तकनीकी अग्रिमों की पैदावार हुई है, जिसमें इंस्ट्रूमेंटेशन के अतिरिक्त isobaric लेबलिंग और मल्टीप्लेक्सिंग क्षमता व्यापक तरल क्रोमैटोग्राफी के साथ संयोजित की गई है अग्रिम, कम नमूना आवश्यक सामग्री के साथ तेजी से, अधिक सटीक माप के लिए अनुमति दी । मात्रात्मक प्रोटियोमिक् उच्च जटिल जैविक नमूनों में प्रोटीन और posttranslational संशोधनों के हजारों के दसियों की रूपरेखा के लिए एक मुख्यधारा दृष्टिकोण बन गए हैं1,2,3,4 , 5 , 6.
division isobaric लेबलिंग विधियाँ जैसे सापेक्ष और निरपेक्ष quantitation के लिए isobaric टैग (जैसे, iTRAQ) और मिलकर मास टैग (टीएमटी) एमएस ने नमूना प्रवाह में काफी सुधार किया है और नमूनों की संख्या में वृद्धि की है जो एक एकल में विश्लेषण किया जा सकता है प्रयोग1,6,7,8. अंय एमएस-आधारित quantitation विधियों, जैसे लेबल मुक्त quantitation और स्थिर आइसोटोप के साथ लेबलिंग सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के साथ (यानी, SILAC), प्रोटियोमिक् क्षेत्र में इन तकनीकों की क्षमता काफी है9 ,10,11. उदाहरण के लिए, टीएमटी विधि 10-plex रिएजेंट का उपयोग करके 1 प्रयोग में एक साथ विश्लेषण करने के लिए १० प्रोटीन नमूनों को अनुमति देता है । इन संरचनात्मक समान टीएमटी टैग एक ही समग्र द्रव्यमान है, लेकिन भारी आइसोटोप अंतर कार्बन या नाइट्रोजन परमाणुओं पर वितरित कर रहे हैं, प्रत्येक टैग के एमएस/ms विखंडन के दौरान एक अद्वितीय रिपोर्टर आयन में जिसके परिणामस्वरूप, जिससे रिश्तेदार quantitation सक्षम 10 नमूनों के बीच । टीएमटी रणनीति जैविक रास्ते, रोग प्रगति, और सेलुलर प्रक्रियाओं12,13,14का अध्ययन करने के लिए नियमित रूप से लागू किया जाता है ।
पर्याप्त तकनीकी सुधार है तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा)-एमएस/एमएस सिस्टम, दोनों नियंत्रण रेखा जुदाई और एमएस मापदंडों के संदर्भ में, quantitation सटीकता त्याग के बिना प्रोटीन की पहचान को अधिकतम करने के लिए । दूसरे आयाम के लिए उच्च orthogonality के साथ एक जुदाई तकनीक द्वारा पेप्टाइड्स के पहले आयाम जुदाई शॉटगन प्रोटियोमिक् विधि के इस प्रकार के लिए अधिकतम परिणाम20प्राप्त करने में महत्वपूर्ण है । उच्च पीएच उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (RPLC) बेहतर प्रदर्शन प्रदान करता है से पारंपरिक मजबूत कटियन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी20। जब उच्च पीएच RPLC कम पीएच RPLC के एक दूसरे आयाम के साथ संयुक्त है, दोनों विश्लेषणात्मक गतिशील रेंज और प्रोटीन कवरेज में सुधार कर रहे हैं, व्यक्त प्रोटीन के थोक की पहचान करने के लिए जब पूरे प्रदर्शन-proteome विश्लेषण की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप15 ,16,17,18. अंय तकनीकी अग्रिमों छोटे C18 कणों (१.९ µm) और विस्तारित लंबे स्तंभ (~ 1 m)19शामिल हैं । इसके अलावा, अंय उल्लेखनीय सुधार तेजी से स्कैन दर, बेहतर संवेदनशीलता और संकल्प20, और एमएस डाटा खनन21के लिए परिष्कृत bioinformatics पाइपलाइन के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के नए संस्करणों में शामिल हैं ।
यहां, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि संशोधनों के साथ सबसे हाल के तरीके शामिल दोनों संवेदनशीलता और प्रवाह में सुधार का वर्णन है, जबकि प्रयोग में गुणवत्ता नियंत्रण तंत्र पर ध्यान केंद्रित । प्रोटोकॉल में प्रोटीन निष्कर्षण और पाचन, टीएमटी 10-plex लेबलिंग, बेसिक पीएच और एसिड पीएच RPLC अंश, उच्च संकल्प एमएस डिटेक्शन, और एमएस डाटा प्रोसेसिंग (चित्रा 1) शामिल हैं । इसके अलावा, हम समस्या निवारण के लिए कई गुणवत्ता नियंत्रण चरणों को लागू करने और प्रयोगात्मक भिंनता का मूल्यांकन । इस विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए शोधकर्ताओं ने क्षेत्र के लिए नए नियमित रूप से पहचान और सही एक lysate या ऊतक से प्रोटीन के हजारों quantitate मदद करना है ।
सावधानी: कृपया उपयोग से पहले सभी प्रासंगिक सुरक्षा डाटा शीट ( यानी , MSDS) से परामर्श करें । इस प्रोटोकॉल को करते समय कृपया सभी उपयुक्त सुरक्षा अभ्यासों का उपयोग करें ।
नोट: एक टीएमटी 10-plex isobar…
हम 10-plex isobaric लेबलिंग रणनीति के साथ प्रोटीन के quantitation के लिए एक उच्च-प्रवाह प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो कई प्रकाशनों में सफलतापूर्वक लागू किया गया है12,13,14,३२ </su…
The authors have nothing to disclose.
लेखक उपयोगी चर्चा के लिए अंय सभी लैब और सुविधा के सदस्यों को धंयवाद । इस काम को नी H पलाश R01GM114260, R01AG047928, R01AG053987, और ALSAC ने आंशिक रूप से समर्थन दिया था । एमएस विश्लेषण NIH कैंसर केंद्र सहायता अनुदान P30CA021765 द्वारा आंशिक रूप से समर्थित सेंट झड बच्चों के शोध अस्पताल प्रोटियोमिक् सुविधा में किया गया था । लेखकों ने पांडुलिपि के संपादन में मदद के लिए निशा Badders का धन्यवाद किया ।
1220 LC system | Agilent | G4288B | |
50% Hydroxylamine | Thermo Scientific | 90115 | |
Acetonitrile | Burdick & Jackson | AH015-4 | |
Bullet Blender | Next Advance | BB24-AU | |
Butterfly Portfolio Heater | Phoenix S&T | PST-BPH-20 | |
C18 tips | Harvard Apparatus | 74-4607 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545 | |
DMSO | Sigma | 41648 | |
Formic acid | Sigma | 94318 | |
Fraction Collector | Gilson | FC203B | |
Glass Beads | Next Advance | GB05 | |
HEPES | Sigma | H3375 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I6125 | |
Lys-C | Wako | 125-05061 | |
Methanol | Burdick & Jackson | AH230-4 | |
Pierce BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Q Exactive HF | |
nanoflow UPLC | Thermo Scientific | Ultimate 3000 | |
ReproSil-Pur C18 resin, 1.9um | Dr. Maisch GmbH | r119.aq.0003 | |
Self Pck Columns | New Objective | PF360-75-15-N-5 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
Speedva | Thermo Scientific | SPD11V | |
TMT 10plex Isobaric label reagent | Thermo Scientific | 90110 | |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Applied Biosystems | 400003 | |
Trypsin | Promega | V511C | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Xbridge Column C18 column | Waters | 186003943 | |
Ziptips C18 | Millipore | ZTC18S096 | |
SepPak 1cc 50mg | Waters | WAT054960 |